基因工程讲稿52.pptxVIP

第四章 哺乳动物基因工程 ;哺乳动物基因转染实验常用的显性选择标记;1．嘌呤和嘧啶的生物合成;APRT：腺嘌呤磷酸核糖基转移酶；HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶；XGPRT：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。;（2）嘧啶的生物合成;2、胸苷激酶基因选择系统 ; 在胸苷激酶基因选择系统中，首先得建立具TK-表型的细胞株。这可以通过诱变加选择的程序获得。; 目前最常用的一种TK- 细胞是小鼠L细胞的TK-突变株。这种突变株的优点是产生回复突变的频率相当低，而且容易被外源DNA所转化，所以使用起来很方便，即便在不使用tk基因作选择标记的情况下，也可用作受体细胞。; (2) HAT选择法;基本原理：如果用叶酸的类似物氨基蝶呤(APT)处理细胞，二氢叶酸还原酶便被抑制，培养基中的还原辅助因子四氢叶酸因得不到补充而逐渐耗尽，于是从dUMP合成dTTP，以及dATP和dGTP的重新合成便因此被阻断。但次黄嘌呤是dATP和dGTP补救合成途径的一种底物，培养基中补加有此种物质时，细胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，继续合成出这些脱氧嘌呤三磷酸(dATP和dGTP)。; 由于在HAT培养基中补加有外源的胸苷，所以TK+细胞通过胸苷激酶的作用可把它合成为dTTP，继续存活下去；而TK-细胞则不会发生这种合成，因而死亡。把正常的tk基因导入TK-细胞，它们也就照样能够存活下去。所以使用HAT培养基，能够选择出由tk基因转化而来的TK+细胞。;(3) 共转化选择 1) 共转化选择的基本过程 ; 在磷酸钙沉淀中，两种DNA分子的混合物，能够同时转化受体细胞。根据这种共转化现象，结合磷酸钙共沉淀技术，人们可以将无选择标记的DNA同具tk选择标记基因的DNA进行混合转化，发展出了共转化选择体系，从而解决了不具tk选择标记基因的转化子的选择问题。;;3．二氢叶酸还原酶基因选择系统; 如果细胞的培养基中含有这些抑制物，例如氨甲蝶呤，其浓度只要达0.1μg／ml，就会阻断核苷酸生物合成，最终导致细胞死亡。;（2）常用的基因: ;2) 另一个dhfr显性选择标记是位于细菌抗药性因子R388上的dhfr基因。它编码的二氢叶酸还原酶，实际上就可以抗MTX的抑制作用。 ;4．氯霉素乙酰转移酶基因选择系统;5．氨基糖苷磷酸转移酶基因选择系统 ;二、外源DNA导入哺乳动物细胞的方法; ①将待转染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2—DNA溶液；; 保温几小时后，将细胞洗净，并更换新鲜的培养液，继续培养至最终实现外源DNA的高水平表达。依培养细胞的不同类型而异，平均每个培养皿中约有10％的细胞捕获了外源转染DNA。据报道，添加甘油或DMSO(二甲基亚砜)会增加某些类型细胞吸收外源DNA的数量。;(2)影响磷酸钙转染效率的因素;2．DEAE-葡聚糖转染技术;(1) DEAE—葡聚糖转染的一般程序; DEAE-葡聚糖的使用浓度为100-1000?g／ml之间。一般在低浓度(200?g／ml)和较长的持续处理时间(8h或16h)的条件下，哺乳动物细胞捕获外源DNA的效率比较高。若在DEAE-葡聚糖处理之后，再加入DMSO等促进因子，还可以进一步提高效率。最高感染率可达80％。;(2) DEAE—葡聚糖转染的可能机理及影响因素; 有许多因素都会影响DEAE-葡聚糖的转染效率，其中以细胞的数量、DNA的浓度和DEAE-葡聚糖的浓度最为重要。;(3) DEAE-葡聚糖转染法的评价; 磷酸钙转染技术十分有效而且易于重复，但最适转染条件的范围比较窄，为此发展出技术条件并不十分苛刻的聚阳离子-DMSO转染技术。; 按此法测定反转录病毒DNA的转化效率，结果是同DNA的加入量成正比，而且不需要加运载DNA(carrier DNA)就可得到稳定的转化。聚阳离子-DMSO转染技术的通用性尚未验证，但已知可适用于鸡胚细胞和小鼠成纤维细胞的转化。;4．基因显微注射技术;(1) 显微注射法;※ 如一个对比实验，一组用pBR322／HSV-1 tk重组DNA注射，结果在500～1000个受注射细胞中，只有一个转变成稳定的转化子；另一组用连接着特定的SV40序列的pBR322／HSV-1 tk重组DNA注射，结果平均每5个受注射细胞中便有一个稳定的转化子，转化频率达20％。; 穿刺法是使用显微注射针穿刺细胞及细胞核，而把外源DNA导入培养细胞或细胞核的一种特殊的显微注射法。; III、在穿刺前弃去培养基，用pH7.2的磷酸缓冲液(PBS)漂洗2次，然后加入浓度为5～1000μg／ml的供体DNA，覆盖于培养细胞表面；;5．电穿孔DNA转移技术; ※ 经过这样处理所得到的存活细胞的回收率约有60％～80％。; 应用电穿