食品生物技术(2).pptx

第二章 食品与基因工程;第一节 概 述;二、基因工程含义、特点及其操作步骤 1、含义 用酶学方法，将异源基因与载体DNA在体外进行重组，将形成的重组子DNA导入宿主细胞，使异源基因在宿主细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需要的生物品种和产物。 ;2、特点 （1）属分子水平上DNA转移过程和细胞水平上的表达。 （2）基因的切割、连接等操作全靠酶学方法。 （3）基因工程整个过程体现不同种间进行无性繁殖，即为克隆过程。 （4）在体外建立无性繁殖体系，易于产业化和规模化，对人类健康和经济建设的发展产生巨大作用。;3、基因工程操作的主要步骤 （1）分离获得目的基因 （2）酶切目的基因和克隆载体 （3）在T4连接酶的作用下，将目的基因与基因载体连接而成重组DNA。 （4）重组DNA导入受体细胞，并在一起扩增成克隆子。 （5）筛选获得重组DNA分子的克隆受体细胞。 （6）进一步扩增、转化和表达，获得转基因生物。;生物材料;三、基因工程的发展 1977年，F. Sanger发明了快速DNA测序技术；Φ×174噬菌体基因组全序列测定（5387bp）。 1982年，基因工程菌（胰岛素），在英国和美国获准使用 1983年，第一个转基因植物（烟草）培育成功 1992年，第一个转基因玉米及转基因小麦植株诞生 1994年，转基因番茄上市 1996年，酵母基因组全序列测定 2003年，人类基因组计划。 ;第二节 工具酶;一、限制性内切酶;;;;;;;;限制性内切酶造成粘性末端 有利于重组DNA 分子的构建 ;;;;异源二聚体 识别序列不同的限制性内切酶，切割后可能产生相同的粘性末端。这类酶的DNA酶解片段都可以在体外重组。在连接酶的作用下，可以得到嵌合DNA称为异源二聚体。这种异源二聚体不再能被原来的限制性内切酶识别，有利于得到大量的重组DNA分子，在基因工程中也显得重要。;限制性内切酶识别序列及反应系统 1、识别序列： 限制性核酸内切酶在双连DNA上能够识别的特殊核苷酸序列称为识别序列。（稀切酶、 同裂酶、 同尾酶） 2、反应系统：反应底物、酶用量、最适pH和最适温度。 1酶活力单位：某种限制性内切酶在最适反应条件下，60分钟内完全切割1微克DNA所需的酶活力，定为1酶活力单位。 反应缓冲系统：氧化镁或醋酸镁、氧化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇或β-巯基乙醇、Tris-HCl或Tris-AC. 温度：多为37℃。;5‘…G-C-T- C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’ ; DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(nick)，即双链DNA上的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而不能封闭裂口(gap)，即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形的单链断裂。;DNA连接酶的种类 目前常用的DNA连接酶有大肠杆菌DNA连接酶和T4连接酶。 大肠杆菌DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接（需要DNA作为辅助因子）。 T4连接酶可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间的连接效率比较低（需要ATP作为辅助因子）。 ;DNA连接酶的连接作用 (a)缺口DNA (b)平末端DNA (c)粘性末端DNA分子 ;;（二）DNA聚合酶 DNA聚合酶的定义 具有催化DNA体外合成反应作用的酶称为DNA聚合酶。这类酶的特点在于，能够把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。DNA聚合酶作用时大多都需要模板，合成产物的序列与模板互补。 常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、 T7 DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶和反转录酶等。 到目前为止，已从大肠杆菌中纯化出了三种不同类型的DNA聚合酶，即大肠杆菌DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。 DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II的主要功能是参与DNA的修复过程，而DNA聚合酶III的主要功能与DNA的复制有关。;基因工程中常用的DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶：是它的发现使PCR扩增特异性DNA片段成为可能。PCR反应过程中需将模板DNA置于高温下变性、解链，而耐热DNA聚合酶在靶DNA变性的高温下仍能保持活性，因而在PCR过程中只需一次性加入反应系统即可，简化了操作过程。 目前有于PCR的耐热DNA聚合酶主要有