基因工程育种硕士课程.pptxVIP

《发酵工程》硕士研究生课程;目标微生物;基因工程育种：通过基因工程的手段把外源基因导入宿主菌细胞，有目的地改造宿主菌的遗传性状的一种育种手段。主要包括以下环节： （1）克隆目的基因；（2）获得高效表达元件（如强启动子等）；（3）构建高效表达载体（包括转化子筛选标记）；（4）建立高效转化体系；（5）目的基因的转化和预期工程菌株的获得；（6）转基因生物的安全性评价。 ;一、基因工程在微生物育种中的作用 二、基因工程载体 三、遗传转化方法 四、基因定位诱变 六、基因工程育种实例 ;基因工程在微生物育种的作用 （一）药物的生产： 1.治疗用药物：人干扰素，人胰岛素，人白细胞介素，人生长素， 动物生长素，松弛素，抑长素，红细胞生成素，肿瘤坏死因子，表皮生长因子，集落刺激因子，血小板生长因子，凝血因子，超氧化物岐化酶，尿激酶，葡激酶等。 2.疫苗：甲肝疫苗，乙肝疫苗，丙肝疫苗，疟疾疫苗，伤寒及霍乱疫苗，出血热疫苗等。;3.单克隆抗体及诊断试剂：前列腺磷酸酶， T-细胞及其亚群，狂犬病毒，风疹病毒，沙眼衣原体，T4, IgE, HCG-?, 抗肝癌、胃癌、肺癌、白血病等单克隆抗体及诊断试剂。 ;深圳市赛百诺基因技术有限公司的工作人员在基因制品生产线上进行操作。这是亚洲惟一的GMP标准的基因治疗产品生产线。 ;重组人p53腺病毒注射液又叫“今又生” 是肿瘤基因治疗药物，由正常人肿瘤抑制基因p53 和改构的5型腺病毒基因重组而成。前者是今又生发挥肿瘤治疗作用的主体结构，后者主要起载体作用，携带治疗基因p53进入靶细胞内发挥作用。;（二）提高菌种的生产能力;（三）改进传统发酵工艺 好氧微生物在发酵过程中需要耗掉大量的氧气，若氧气不足产量下降。在生产菌株中转化进血红蛋白基因，可提高生产菌对氧气的耐受能力。;（四）提高菌种抗性 如（1）酵母只能在低温进行保存和运输，改变基因使得酵母能在干燥条件下常温保存和运输。 （2）不耐低温的草菇，转进抗冻蛋白基因使其耐寒。;（五）环境处理： 构建超级菌株 降解质粒： （1）石油降解质粒； （2）农药降解质粒； （3）工??污染降解质粒，如降解氯联苯、尼龙低聚体、洗涤剂等； （4）抗金属离子质粒，如汞、砷、镍、钴、镉、铜等;二.目的基因的分离 根据特异蛋白质分离目的基因 根据特异mRNA分离目的基因 利用DNA插入分离目的基因（插入诱变法） 利用基因定位分离目的基因（图位克隆法） 利用表达序列标签分离目的基因 利用同源序列分离目的基因（同源克隆法）; 根据特异mRNA分离目的基因 （1）差别杂交（differential hybridization）, 又称：差别筛选（differential screening） （2）缩减杂交（subtractive hybridization）， 又称：缩减cDNA克隆（ subtractive cDNA cloning） （3）mRNA差别显示（mRNA differential display reverse transcription polymerase chain reaction, DDRT-PCR） ;（4）抑制性消减杂交（suppressive subtractive hybridization，SSH） （5）代表性差异分析（representational difference analysis，RDA） （6）cDNA扩增片段长度多态（cDNA-amplified fragment length polymorphisms， cDNA-AFLP） ;实验原理：;材料准备;技术路线;总RNA的提取及反转录;接头的设计;预扩增结果;选择性扩增的优化结果;选择性扩增的优化结果;片断的回收和测序;片断的分析; 利用同源序列分离目的基因 （同源克隆法） 目的基因相关同源序列 PCR扩增保守序列 筛选基因文库 目的基因全长;三. 基因工程载体;;表达质粒载体: 组成：启动子，终止子，目的基因，抗性筛选标记基因。 ;限制性内切酶及其酶切位点;Eco RI 5’ -G A A T T C- 3’ 3’ -C T T A A G- 5’;表达载体构建;食用菌常用启动子： 1）ras （Le.ras.gene）启动子； 2）gpd(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)启动子；