实验一凝胶过滤层析分离蛋白质.ppt

生物化学与分子生物学实验 带教: 张学礼、戴薇薇 龚张斌、黎志萍 * PPT课件 实验课要求 试剂用后及时归位 及时记录实验结果 按时完成实验报告 离开时做好清洁工作 * PPT课件 实验报告的书写 标题日期 一、实验目的 二、实验原理 三、操作步骤 四、实验结果 五、分析讨论 * PPT课件 实验基本操作 一、玻璃仪器的洗涤 二、吸量管及微量取样器的使用 三、溶液的混匀 四、离心机的使用 * PPT课件 实验一 凝胶过滤层析法分离蛋白质 1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。 一、 实验目的 * PPT课件 二、 实验原理 1. 常用生化实验技术 分光光度技术 电泳技术 离心技术 层析技术 * PPT课件 2. 层析技术（色谱技术） 是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 和力等）建立起来的技术。 * PPT课件 （1）层析系统的基本组成 固定相 + 流动相 固体物质 / 固定于固体物质的成分 可以流动的物质：如水和各种溶媒 * PPT课件 待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比）不同 与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快 分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一 组分，从而达到将各组分分离的目的 * PPT课件 （2）层析法的分类 按两相所处状态分类 流动相 液体 气体 固定相 液体 液—液层析法 气—液层析法 固体 液— 固层析法 气— 固层析法 * PPT课件 按层析原理分类 名称 原理 吸附层析法 固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力不同而分离 分配层析法 各组分在流动相和固相中的分配系数不同 离子交换层析法 固定相是离子交换剂，各组分与离子交换剂亲和力不同而分离 亲和层析法 固定相只能与一种待分离组分专一结合，以此和无亲和力的其它组分分离 凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同 * PPT课件 按操作形式不同分类 名称 操作形式 柱层析法 固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离的层析法，包括一般柱层析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法 平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄膜层析法 * PPT课件 （3）层析技术的优点 分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广 适用： 杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析 * PPT课件 3. 凝胶过滤层析法（gel filtration chromatography） （1）原理： 根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗 粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部， 大分子物质被排阻在外。 又名分子筛过滤，排阻层析 * PPT课件 * PPT课件 （2）凝胶的特点 属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要 有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。 交联葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶 * PPT课件 （3）凝胶的选择 葡聚糖凝胶 (商品名: Sephadex，Dextran) 型号: G-10 – G-200 多孔网孔结构 数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小 吸水能力，每g干胶吸水量的10倍 * PPT课件 Sephadex G-50： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 1500 – 30000 Sephadex G-200： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 5000 – 80000 例： * PPT课件 B. 琼脂糖凝胶 ( 商品名: Sepharose , Bio- gel – A ) 对实验条件要求高 ( 温度, pH ) ＜40℃ 4.5- 9.0 工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限, 用于大分子物质的分离 * PPT课件 C. 聚丙烯酰胺凝胶 商品名: Bio – gel – P（生物胶P） * PPT课件 三、实验操作 1. 柱的选择 直径： 1~5 cm 一般长度：直径 = 10：1 ~ 20：1