《DNA印迹与杂交技术》.pptVIP

转移的最佳条件 i) 固定基质的选择 ii) 转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的SDS。 iii)大分子的转移 　对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。 其步骤是： 0.25M HCl处理凝胶两次（每次15分钟）→水洗→0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次15分钟→转移。 5、Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA 6. 杂交结果的检测 化学显色或放射自显影 标记的探针 探针 探针技能，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技能，我们把标记的分子叫探针（Probe） 从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。如抗体--抗体、外源凝集素--碳水合合物、亲合素--生物素、受体--配基（Ligand）以及互补核酸间的杂交均属于探针--靶分子反应。 （一）探针的种类 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 （二）标记物 理想标记物应具备的特性： 高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性 标记物种类 核素标记物：32p、35s、3H 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光 （三）标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中 体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应， 标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上 酶促标记法 切口平移法（nick translation) 1、利用DNase I在DNA双链上造成单链切口 2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5??3?核酸外切酶活性在切口处将旧链从5?末端逐步切除 3、在DNA聚合酶I的5??3?聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3?末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中 随机引物法 其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5??3?方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中 随机引物法所具有的优点： 1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记 2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题 3、标记活性高，标记活性可达108cpm/μgDNA以上 4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记 （四）探针的纯化 1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质 2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DN