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昆明医学院第二附属医院检验科  杨红英 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性 酶免疫技术的原理 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 特点 抗原抗体反应的特异性与酶高效催化反应的专一性 相结合 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联，衍生出适用范围更广的新方法。 酶及作为标记酶的要求 活性高：低浓度底物，高催化反应 有与抗原、抗体共价结合的集团 标记后不影响稳定 显色信号易于判断和测量 底物易于配制保存且对人体无害 酶及底物价廉 常用酶-辣根过氧化物酶（HRP） 来源于植物 特点： 糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）的结合物纯度用纯度数（RZ）表示，与酶的活性无关，酶活性以单位U表示。酶变性后RZ不变但活性降低。 优势：容易获得、价廉、稳定 常用于ELISA 常用酶-碱性磷酸酶（AP） 来源于大肠杆菌或小牛肠黏膜，二者的理化性质不同。 特点： 敏感性高于HRP，本底低。 不容易获得高纯度制剂，稳定性低、价格高。 多用于均相酶免疫测定 常用底物 邻苯二胺 OPD： OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。 缺陷：不稳定，致癌。 常用底物 四甲基联苯胺 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm 。 优势：稳定，无致癌性， ELISA中应用最广泛的底物。 需注意在溶液中不稳定 戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合 该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。 改良过碘酸钠法 过碘酸钠氧化酶的多糖羟基为醛基，醛基+抗体蛋白中的游离氨基→Schiff 碱， Schiff 碱 + 硼氢化钠→稳定的酶标志物 常用于HRP标记抗体或抗原 　酶免疫技术分类 EMIT示意图(enzyme-multiplied immunoassay technique） CEDIA示意图（cloned enzyme donor immunoassay） 分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定 　酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assy，ELISA） 　 竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 特 点 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） 酶标记抗原与样品中的非标记抗原具有相同的与固相抗体结合的能力 反应体系中固相抗体和酶标抗原是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记和非标记抗原的分子数量和 判读结果：结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原的量与样品中非标记抗原的浓度成反比 3、竞争法 原理：抗原+固相载体→ 固相抗原+待测标本/酶标抗体 ↓ 待测标本/酶标抗体竞争与固相抗原结合 ↓ 显色 颜色深浅与待测物含量成反比 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 捕获法 ELISA应用中的质量控制  酶标仪 滤光片波长精度检查 用紫外可见光分光光度计对滤光片进行扫描，检测值与标定值之差即滤光片波长精度，应±1.0nm 。 通道差检测：取一只酶标板小孔，以酶标板架做载体，内加200μl甲基橙溶液，吸光度值调至0.500A左右，先后置于8个通道的相应位置，蒸溜水调零，于490nm 处连续测3次，观察其不同通道的检测器测量结果的一致性，可用极差值来表示，应0.015。 孔间差的测量：选择同一厂家同一批号酶标板分别加入200μl甲基橙溶液，先后置于同一通道，蒸溜水调零，于490nm 处检测，其误差大小用士1.96S衡量， 0.005A。 标本的采集和保存  血清：避免溶血，避免长菌。 标本在冰箱中保存时间过长，易导至血清中IgG聚合，使用间接法的试剂盒可使本底加深。一般血清置4℃冰箱5天内完成测试。如需保存1周