生物技术制药重点(一).docVIP

生物技术制药重点 第一章 绪论 2.生物技术：又称生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。 3.生物技术药物：是指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物，如细胞因子、纤溶酶原激活剂等。 4.生物技术制药：是指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。 第二章 基因工程制药 1.基因工程：又称重组DNA技术，即在体外将DNA片段与载体连接，形成重组DNA，在宿主细胞中复制、扩增和表达蛋白质所用的方法和技术。 2.基因工程制药：利用重组DNA技术将外源基因导入宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获得蛋白质药物的过程。 3.基因工程制药的基本流程： ①目的基因的获得；②表达载体的选择；③目的基因与表达载体的连接；④重组DNA转入受体细胞；⑤重组子的筛选与鉴定；⑥工程菌株发酵表达重组蛋白；⑦重组蛋白产品的纯化；⑧重组蛋白制剂的生产。 4.限制性核酸内切酶：主要指来自于细菌、能够识别DNA特定序列、并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。具有专一性。 5.DNA连接酶：可以催化DNA片段中两个相邻的3-OH和5-磷酸基团（互相配对的两个粘性末端连接起来）形成3，5-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单链断裂形成的缺口连接起来。 6.获得目的基因的主要方法： ①化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其编码产物的氨基酸残基序列。＜100个碱基。 小片段粘接法：12-15个碱基，退火形成双链；大片段酶促法：100个碱基以下，利用聚合酶和连接酶形成。 ②PCR：（已知目的基因的序列）根据生物体内DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，引物依赖DNA模板特异性地扩增DNA。 PCR体外扩增常容易带入突变，为保证目的基因片段序列的正确性，一般建议使用高保真的DNA聚合酶和相对保守的PCR扩增条件。同时PCR得到的片段在克隆后必须进行测序分析。 ③cDNA文库法：表示表达信息的微生物。代表了细胞或组织所表达的全部蛋白质，从中获取的基因序列也都是直接编码蛋白质的序列 ④基因组DNA文库法：表示遗传信息的微生物。是指某一特定生物体全部基因组DNA序列的随机克隆群体的集合，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息，包括所有外显子和内含子。 7．质粒的结构和特点： （1）细胞拟核之外的小的环状DNA分子 （2）存在于细菌、霉菌、酵母菌等细胞里，对细胞的正常生活几乎没有影响 （3）能够在宿主细胞中自主复制 （4）可以容易地从细胞中取出或放入 2.载体的要素、分类 P13 （1）质粒载体的三个要素:复制子（复制起始点），选择标记（用于鉴定和筛选转化有质粒的宿主细胞），多克隆位点（质粒载体中由多个限制性核酸内切酶识别序列密集排列形成的序列，用于将目的基因插入多克隆位点中相应的酶切部位）。分为克隆载体（用于外源DNA的扩增），表达载体（用于外源目的基因的有效转录和翻译），突变载体（通过对载体抗性的选择来实现筛选突变克隆的目的），报告载体（以易于检测的基因作为报告基因，通过报告基因的表达强度来研究外源调控因子的功能）。（2）载体分质粒载体和λ噬菌体载体（常用于构建基因组文库和cDNA文库）。入噬菌体载体分为插入型和置换型两类。 3.重组DNA导入宿主细胞 常用方法：①转化；②感染；③转染；④显微注射；⑤电穿孔 重组DNA导入细菌： 化学转化法：对数生长期细菌② 感染法：以病毒形式 穿孔法：高压脉冲 重组DNA导入酵母：①电转化法（方便、快速、高效）；②化学转化法（简单、设备要求低）；③原生质体转化法 重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法和电转化法；转染法；病毒感染法。 4.重组子的筛选与鉴定 1)载体遗传标记法：抗生素抗性筛选法；α-互补筛选法；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法 2)核酸分子杂交法 3)限制性内切酶图谱法 4)DNA序列测定法 5)目的基因表达产物测定法 基因重组蛋白的主要纯化技术 P26-28 （1）离子交换层析:利用蛋白质等电点的差异，通过带电的溶质分子与离子交换剂中可以交换的离子进行交换。 a.离子交换剂：阴离子交换剂、阳离子交换剂、两性离子交换剂、选择性离子交换剂。 b.影响因素：盐离子浓度、离子大小、洗脱梯度与流速。 （2）亲和层析：利用固定化配基于目的蛋白之间特异的生物亲和力进行吸附。 a.亲和作用包括酶与激活剂/受体/底物之间、抗体与抗原之间、受体与激素/配体之间、蛋白质与DNA/RNA结合域之间。 b.亲和层析