细胞蛋白提取及定量.docVIP

一、蛋白获取----cell裂解（冰浴操作） 试剂： ① RIPA---cell裂解液 ② 蛋白酶抑制剂100× PMSF;50× Cook tail ③ 4× loading ④ 待裂解cell在冰上冻融，试剂 配制裂解液 RIPA 100μl n 100× PMSF 1μl = nμl 50× Cook tail2μl 2nμl 步骤： ① 去除6孔板培养基，PBS洗2遍 ② 将配制好的裂解液按照100μl/well（根据细胞量来确定需要加裂解液量）混合后加 入6孔板（60mm为300μl），冰上裂解30min。 ③ 用细胞刮将将裂解后的cell和裂解液混合液刮净，并转移到1.5ml离心管中，以 15000rpm/30min/4℃离心，收上清 ④ 取2μl用于测量蛋白浓度，其他用作western blottiing ⑤ BCA法测蛋白浓度 a) 取上清2μl稀释25倍（2μl上清+48μl H2O）置于新EP管中 b) 配制标准品 c) 配制工作液 (# standards + # unknowns) × (# replicates) × (volume of WR per sample) = total volume WR required；only 200μL of WR reagent is required for each sample in the micr