单抗N糖谱测定法.PDFVIP

单抗N 糖谱测定法 第一法 亲水相互作用色谱法 本法系通过N糖苷酶F （PNGase F）对单抗N糖进行酶切、对酶切的N 糖进行标记衍生，然后用超高液相色谱法对单抗N糖谱进行测定。 照高效液相色谱法 （通则0512）测定。 试剂 (1) N 糖苷酶F （PNGase F） (2) 2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记溶液: 取350 μl 二甲基亚砜 （DMSO）和150 μl 乙酸，混均。精密称取25 mg 2-AB 加入上述溶 液中，充分溶解。精密称取30 mg 氰基硼氢化钠加入上述溶液中， 充分溶解 （可适当加热）。 (3) 系统适用性对照品。 色谱条件 用酰胺基键合硅胶填充色谱柱，柱长150mm，内径2.1mm，粒度1.7 μm，或等效色谱柱；柱温为60℃，供试品保存温度为2～8℃；以 50 mmol/L 的甲酸铵溶液 （pH4.5）为流动相A 液，以乙腈为流动相 B 液，梯度洗脱60.0 分钟 （梯度表）；荧光检测器检测，检测波长 为：激发波长330nm，发射波长420nm，增益10。 系统适用性对照品溶液的制备 ( 1 )N糖的酶切 准备30kD 的超滤离心管，加入150 μl 的超纯水，每分钟13000 转 离心5 分钟 （舍弃残留有大体积液体的超滤管，并处理新的超滤 管）。加入200 μl 10mg/ml 的样品至超滤管中，每分钟13000 转离 心10 分钟，丢弃下层液体。向上层截留样品中加入400 μl 的 10mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4），每分钟13000 转离心 10 分钟，重复两次，吸取全部上层截留样品转移至离心管中。吸取 150 μl 10 mmol/L 的PBS 润洗上层超滤管，并转移至对应的EP 管 中（浓度约为10 mg/ml）。取25 μl 置换缓冲液后的样品，加入5 μl PNGase F 和70 μl 的10 mmol/L 的PBS，总体积为100 μl，涡 旋混匀并短暂离心，37℃水浴下孵育20 小时。 ( 2 )蛋白去除和N糖的标记 向酶切完的样品中加入三倍体积预冷的乙醇，涡旋混匀，-20℃放置 1 小时沉淀蛋白。每分钟13000 转离心10 分钟。吸取适量上清液 (如360 μl)至离心管中离心干燥。待完全干燥后，加入10 μl 2- AB 标记溶液，涡旋混匀并短暂离心。65℃下孵育4 小时。 ( 3 )标记的N糖纯化 采用凝胶过滤或固相萃取，按照说明书进行操作对标记的N糖进行纯 化，以去除游离的2-AB，离心干燥纯化的样品，用100 μl 70%乙腈溶 液复溶。 供试品溶液的制备 参照系统适用性对照品制备方法进行制备。 空白对照溶液的制备 空白对照系按照制剂配方配制，但不含有单抗的溶液。参照系统适用 性对照品制备方法进行制备。 测定法 分别量取制备好的系统适用性对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶 液，注入色谱仪，记录色谱图。进样量为5 μl。 进样顺序：空白对照溶液（进样1针）、系统适用性对照品溶液（至少 进样2针）、供试品溶液1、供试品溶液2 ······、系统适用性对 照品溶液 （至少进样1针）。 系统适用性 系统适用性对照品的色谱图应与典型图谱相似 系统适用性对照品G1F （1,6）和G1F （1,3）的分离度不低于1.8 系统适用性对照品G0F峰面积%应在规定范围内（见该批次对照品说明 书） 系统适用性对照品G0F的保留时间RSD应不高于4% （n≥3） 结果分析 按面积归一化法计算，各N糖型峰面积占所有峰面积之和的百分比即 为该N糖的相对百分含量。 梯度表 时间/分钟 流速/ml•min-1 A 液/% B 液/% 起始 0.50 22.0 78.0 38.5 0.50 44.1 55.9 39.5 0.25 80.0 20.0 44.5 0.25 80.0 20.0 46.5