免疫组化的原理与操作.pptxVIP

免疫组织化学; 概念：免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 是利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫学和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也叫原位免疫学（In situ immunology）。 特点或优点：（1）特异性强、灵敏度高； （2）可定性、定位、定量观察； （3）将形态学改变与功能和代谢变化结 合起来； ; IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平）能对组???和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。 随着IHC技术的发展和图象分析技术的发展，IHC已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，使IHC在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不仅用于研究，也用于诊断。IHC与核酸分子杂交相结合形成的原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。; —— IHC技术源于免疫荧光术（immunofluorescence, IF），从1941年~1950年Coons等用了10年首创了 荧光素标记抗体技术——检测肺组织内的肺炎双 球菌，六、七十年代IF在科研中占据着主导地位 ——1968 年中根一穗（Nakane）等创建了酶标抗体技 术（immunoperoxidase，IPO）——铁蛋白标记 Ab技术; ——1974年Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧 化物酶－抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫 细胞化学得到广泛应用；;——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—银染色 法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 ——90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细 胞化学分类方法迅速发展； ——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组 化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合 研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个 学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技 术之一； ——国内起步晚，从70s开始。 ; （一）方法学 1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）→亲和反应。新的亲和物质对有：生物素与卵白素（biotinavidin)，葡萄球菌A蛋白（SPA）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学（affinity histochemistry），这些方法特异性、敏感性、稳定性高，更方便、适于某些特殊观察（如EM）。 2.从单一显示某种物质（单标记）→显示多种物质（双标记）。 3.从LM→EM（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。 4.从定性→定量，图象分析（IA）、流式细胞术（FCM）。 5.IHC与ISH相结合，可在不同水平检测DNA、mRNA、protein。 6. 原位PCR+IHC可在组织原位通过扩增检测微量目的DNA。 7. 趋于标准化、自动化。;（二）技术分类 1. 根据染色方式分成：① 贴片染色 ② 漂浮染色 2. 根据Ag-Ab结合方式分成： ① 直接法 ② 间接法 ③ 多层法 3. 按标记物的性质分成： ① 免疫荧光技术（免疫荧光法） ② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、 ABC法） ③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色 法、蛋白A金法） ;（三）标记物 1. 必要性：组织细胞内Ag-Ab结合反应一般是不可 见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。 2. 常用标记物 ① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（ Fluorescein isothiocyanate ，FITC）---