四)液相色谱柱子使用及保养-0702.ppt

重复性差、回收率低 实验的重复性差 色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定 回收率低，不出峰 “不可逆”吸附 固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附 色谱柱的日常清洗 对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗（如反相C18柱用100%甲醇或乙腈） 硅胶柱的一般方法 先用甲醇洗去极性杂质，再用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化 键合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 柱子尺寸 柱子体积 冲洗体积 150x4.6mm 2.5ml 50ml 200x4.6mm 3.3ml 65ml 250x4.6mm 4.2ml 80ml **再有杂质严格清洗： 20倍柱体积的水-相同体积的0.05mol/L硫酸，最后用流 动相清洗 色谱柱的清洗-物理阻塞 在安装柱前后测试压力差 如果柱压力太高，反装色谱柱，并用10-20倍柱体积的 流动相冲洗色谱柱，监测压力变化 若出现沉淀 (如：蛋白凝聚、细胞物、聚合物) 设法用相应的可溶性溶剂，如 0.1% TFA/ 80% 乙腈, 6M 盐酸胍, THF, HFIP 若仍无效，应考虑更换过滤片 色谱柱头塌陷的修补 柱头有塌陷可用填料修补： 1）松开柱入口接头，拆下不锈钢烧结过滤器，常见柱头塌陷，剔掉无规则床层和带色填料，使柱床呈白色水平面，滴一滴甲醇，加少许填料使沉降，如此反复多次后，用刮刀将填料刮平，放上清洗过的不锈钢烧结过滤器，装上柱入口接头，把柱重新接到LC仪器上慢慢地增加流速，直到操作上限为止。 2）如果柱头塌陷较深（小于1cm）可逐渐减低流速至零，再次拆下柱子，用填料修补直到塌陷填满为止。 色谱柱的存放 存放前的处理 除去杂质、盐等，防止细菌生长 合适的存放溶剂 两端密封保存，避免色谱柱床干枯 避免机械震动 注意存放的温度 色谱柱以外的因素（一） “柱效”问题，不一定是色谱柱问题！ 仪器问题：连接不好造成死体积 进样器 检测器 管路，连接口 保护柱 在线过滤器堵塞 流动相问题：色谱柱未平衡好 进样量太大 色谱柱与仪器的联接 不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造成： 色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏 解决办法： 使用“通用”型接头（锥箍及螺母） 这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱柱上的。 色谱柱以外的因素（二） 柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！ 系统反压问题 阻尼器堵塞 进样器堵塞 管路或连接口堵塞 在线过滤器不干净 保护柱 压力传感器不准确 流速是否错误? 色谱柱以外的因素（三） 实验的重复性差 梯度实验时平衡时间不足 温度波动 流动相组成改变 样品溶剂不同 样品稳定性不好 方法的开发不好 缓冲液的pH值不合适 缓冲液的缓冲能力不足 手动进样器-六通阀的结构 手动进样器清洗 为避免出现怪峰，冲洗注射针时最好用流动相（不含盐）冲洗 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * * * 液相色谱实用技术 色谱柱的使用和保养 色谱柱的选择 非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱 酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的C18柱，PH范围2-9（12） 糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPC有专用柱 键合相色谱柱 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的60-70% 优点∶ 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点∶ pH值不能小于2或大于8 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同 反相HPLC柱（C18）的性能 常规C18填料的稳定性 硅胶基质填料 pH范围：2-8 pH值大于7时键合相粉碎或溶解 pH值小于2时键合相的化学键断裂 经常用缓冲液 固定相降解 填料新的键合技术 - PH范围 2-