海洋大学生物化学实验教案.ppt

实验 Folin-Wu法定量测定血糖的含量 一、目的要求 1、掌握Folin－Wu法测定血糖含量的原理和方法。 2、学会制备无蛋白血滤液。 二、实验原理 Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+(Cu2O) Cu2O +酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物 OD420比色 无蛋白血滤液中的葡萄糖和碱性硫酸铜溶液共热反应，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）,Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物—钼蓝 。 血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。 二、实验仪器 1、? 新鲜兔子血 2、? 滤纸 3、? 血糖管（25ml） 4、? 奥氏吸管（1ml） 5、? 锥形瓶（50ml） 6、? 漏斗 7、? 电炉 8、? 水浴锅 9、7200型可见分光光度计 5、酸性钼酸盐溶液： 称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。 置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。 2、血糖的定量测定： 取25ml的血糖管(见图1)3支，编号。第一支血糖管中加入1ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加1ml标准葡萄糖液；用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液1ml，放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7220分光光度计在420波长处比色，以空白管调节零点。 实验 肝糖元的提取和鉴定 一、实验原理 糖原在浓碱中稳定，将肝组织先置于浓碱中加热，使蛋白质及其他成分分解而保留肝糖元。再用浓硫酸使糖原脱水生成糖醛衍生物，衍生物和蒽酮作用形成蓝色化合物，与同法处理的标准葡萄糖一起比色定量。 三、实验试剂 1、30%NaOH溶液：30gNaOH溶于100ml蒸馏水中 2 、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：准确称取10mg分析纯葡萄糖（预先在110干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定容至100ml. 3、显色剂：称取0.2g蒽酮加入100ml浓硫酸中。此试剂不稳定，以临用时配用为宜，冰箱保存可用4—5天 四、实验步骤 1、准确称取肝组织0.5g，放入盛有1.5ml30%NaOH的试管中，置于沸水浴中加热20分钟，取出后冷却，将管中内溶物全部转移到100ml容量瓶中（用蒸馏水多次洗涤试管，一并收入容量瓶）加蒸馏水定容。 2、取干燥试管三支，注明空白管、标准管、测定管，按下表进行操作。加毕，摇匀，置沸水浴中10分钟，冷却，以空白管调节零点，在620nm波长下比色测定。 五、结果计算 100g肝组织中所含糖原的克数 =（OD测/OD标）×C标×2×100×（1/1000）× （100/111）× （100/0.5） 注：100/111是此法测的葡萄糖含量换算为糖原含量的常数，即100g糖原用蒽酮试剂显色相当于111g葡萄糖用蒽酮试剂所显得色 实验二 蛋白质的部分性质 一、试验原理 蛋白质分子中某种或某些基团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。 二、实验仪器 1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴锅 三、实验试剂 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。 2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。 3、Millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。 4、尿素晶体 5、1%CuSO4：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml 7、浓硝酸 8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml. 9、 冰醋酸 10、浓硫酸 四、实验步骤 （一）?? 米伦（Millon’