基因工程工具酶培养训练课件.pptVIP

第二章 基因工程工具酶; 大肠杆菌DNA聚合酶 （DNA PolⅠ ) 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段 （Klenow Fragment|） 2.DNA聚合酶类 嗜热DNA聚合酶（Taq酶 ） DNA连接酶 ( Ligase ) 反转录酶（Reverse Transcriptase) ;（一）限制性核酸内切酶的发现 （二）限制性核酸内切酶的分类 （三）限制性核酸内切酶的命名 （四） II型限制性核酸内切酶的基本特性 （五）限制性核酸内切酶的消化反应条件;;限制—修饰的酶学系统; E.coli B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。;1962年瑞士的W.Arber（阿尔伯）提出细菌的限 制修饰系统。1968年发现Ⅰ型内切酶; 1968年美国的H. O. Smith发现Ⅱ型内切酶; 1970年美国的O. Nathans（内申斯）用Ⅱ型酶制备了肿瘤基因; 1978年三人共获诺贝尔生理与医学奖。;从此，相关研究展开。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的 。 概念: 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3,5-磷酸二酯键。 ;（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性;（三）限制性核酸内切酶的命名;（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点;几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点;与II型核酸内切酶有关的几个概念;平齐末端; 同裂酶切割DNA时，产生相同的粘末端，故被切割得DNA可重组并且重组后产生两种情况A.B,如图： MobI BamHI BglII 5’…NGATCN…3’ 5’N…GGATCC…N3’ 5’N…AGATCT…N3’ 3’…NCTAGN…5’ 3’N…CCTAGG…N5’ 3’N…TCAAGA…N5’ 5’…N GATCC…N3’ 5’N…G GATCT…N3’ 3’…NCTAG G…N5’ 3’N…CCTAG A…N5’ 5’N…GATCC…N3’ 5’…NGCATCT…N…3’ CTAGG…N5’ CGTAGA…N…5’ A: 可被MobI识别切割，但不被 B:重组DNA,-不能被上述酶识别 BamHI识别切割。 与切割。;注意;;酶活单位 一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1 ?g ? DNA所需要的酶量。 ;酶 切 反 应 的 基 本 步 骤; 在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性，用*表示。 限制性内切酶的第二活力 （Se