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微生物限度与无菌检查法验证实验体会 马仕洪 mash@nicpbp.org.cn Tel: 010 - 6709 5509 验证实验的几点体会 无菌检查法验证实验要点 微生物限度检查法验证实验要点 验证实验实例 无菌检查法验证实验要点 样品 菌种和实验用菌液 标准化操作 实验器材 无菌检查样品 无菌检查样品 主要是取样量的问题 《中国药典》2005年版对无菌检查的“检验数量”和“检验量”作了明确的解释和规定。 表2中上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量 * 每种培养基各接种10支供试品 表3中上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量 表3注释 *1 ：每种培养基各接种10支供试品。 *2 ：抗生素粉针剂(≥5g)及抗生素原料药(≥5g)的最少检验数量为6瓶(或支)，桶装固体原料的检验数量为4个包装。 *3 ：如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。 无菌检查样品 三点体会： 一是附录规定检验量的表格中不包括阳性对照用样品量，虽然附录另处有专门说明，仍然容易忽略； 无菌检查样品 三点体会： 二是无菌检查时应强调“检验数量”，主要是保证实验结果的代表性，而阳性对照实验和验证实验仅须满足“检验量”总量要求即可，以检验样品对实验结果的影响，即保证实验结果的可靠性，验证实验可以由此减少大量的样品； 无菌检查样品 三点体会： 三是对“检验数量”和“检验量”的把握应考虑便于实际操作，比如处理100ml/袋的样品，取9袋样品一次分配到一组三联滤器，“检验数量”大于药典规定的6个，但“检验量”似乎不符合药典规定的每袋样品取半量检验的规定，仅为1/3，但根据药典“检验量”即为“一次实验所用供试品的总量（g或ml）”的解释，这与先将6袋分配两个滤筒、再将剩下3袋抽入一个滤筒作为阳性对照的方法一样，却更节省时间。 菌种和实验用菌液 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis [CMCC（B）63 501] 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus [CMCC（B）26 003] 生孢梭菌 Clostridium sporogenes [CMCC（B）64 941] 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa [CMCC（B）10 104] 大肠埃希菌 Escherichia coli [CMCC（B）44 102] 白色念珠菌 Candida albicans [CMCC（F）98 001] 黑曲霉 Aspergillus niger [CMCC（F）98 003] 菌种和实验用菌液 验证用菌种的保藏 使用频繁 传代限制（5代） 菌种和实验用菌液 2）、标准菌株保藏和实验用菌液的制备 菌种和实验用菌液 各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。 菌种和实验用菌液 参考菌液制备标准程序： 取经34℃培养18-24小时的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿假单胞菌与大肠埃希菌的营养肉汤培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，分别10倍稀释备用（枯草芽孢杆菌至10-5、金黄色葡萄球菌10-6、绿假单胞菌与大肠埃希菌至10-7）； 菌种和实验用菌液 参考菌液制备标准程序： 取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-7备用； 菌种和实验用菌液 参考菌液制备标准程序： 取经24 ℃培养18～24小时的白色念珠菌改良马丁培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5备用； 菌种和实验用菌液 参考菌液制备标准程序： 取经培养一周的黑曲霉菌改良马丁琼脂斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液5ml，洗下孢子，转移至另一空管，加0.9%无菌氯化钠溶液至与标准比浊管浊度相当后，取1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-4备用。 菌种和实验用菌液 关于黑曲霉： 关于黑曲霉 关于黑曲霉 菌种和实验用菌液 菌液检验： 结合验证实验方法进行活菌计数。 生孢梭菌可在同步硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度实验中计数。 标准化操作 方法选择 样品处理 冲洗方法和条件 中和剂加入 菌液加入 标准化操作 方法选择 取样量大于5ml/支直接接种法不再适用； 除非样品不许可（难溶解），发展趋势应采用全封闭的薄膜过滤法。 标准化操作 样品处理 主要强调固体样品的溶解、转移、均匀分配问题。通常将规定取样量全部转移到400～500ml稀释剂或者适宜溶液，再进行分配。