病毒学研究方法的简介.pptVIP

6、电泳法 普通电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等 7、柱层析法 吸 附：用离子交换或吸附法 分子筛：琼脂糖或葡聚糖制成凝胶柱 8、抗血清处理 针对寄主蛋白的血清来沉淀杂蛋白 加病毒的抗血清形成病毒—抗体复合物 （三）病毒提纯的技术 二、病毒的分离与培养 硫酸铵沉淀法 （四）植物病毒提纯举例1 PVX病植株汁液 澄清的汁液+饱和硫酸铵 2 ：1 去上清，沉淀悬浮在生理盐水或buffer 静置30min 11500g 离心 10min 流水透析2h， buffer或生理盐水透析1夜 3800g 离心 10min，去杂质 也可低速离心 提纯的病毒悬液可直接使用，也可进一步重复沉淀提纯 弃沉淀，上层即为提纯的病毒悬液 超速离心法 （四）植物病毒提纯举例2 CMV病叶+ buffer+巯基乙酸，匀浆 500g 离心 15min，留上清液 80000g 离心30min,留沉淀+缓冲液 澄清液+聚乙二醇，溶解后静置30min（沉淀病毒） 低速离心10min（5000g) 保留上清液 超速离心 150min (75000g) 留沉淀，缓冲液悬浮 15000g 离心20min, 保留上清液 上清液即为提纯的病毒悬液，也 可 重复进一步提纯 动物培养 鸡胚培养 组织培养 原代细胞：新鲜组织+胰蛋白酶消化，分散+培养液 成——单层细胞 二倍体细胞株：原代细胞传代（为二倍体细胞） 传代细胞系：肿瘤组织或二倍体细胞自发转化（非整倍体） 动物病毒的培养 二、病毒的分离与培养 病毒学研究的主要方法 生物学特性测定:在寄主上的反应——症状、传播等 病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法 光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况 免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体 分子生物学技术：核酸分子杂交、PCR等 标本制备 浓缩标本有以下几种方法： ① 超速离心 离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心机转头的半径，一般是30min到3h．沉淀的样本用灭菌蒸馏水洗后再放到铜网上； ② 超过滤法 用于分子筛的蛋白质相对分子质量为10000； ③ 接种细胞 接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切片； ④ 免疫凝集 如有特异抗血清，且病毒已知，也可用该法浓缩病毒 三、病毒的光镜与电镜观察法 光 镜：寄主组织切片、包含体 三、病毒的电镜观察法 1、正染法（超薄切片法、病组织） 将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒，通常1~2 d完成。 操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过程。 2、负染法 直接将病毒悬液(也可用细胞)滴在铜网上，用重金属(通常用磷钨酸)进行染色，观察病毒颗粒，10-20min可出结果。 原理：负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上显示亮区——较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。 缺点：敏感性低，要求病毒量在107／mL以上，同科病毒难于鉴别。 3、投影技术 4、胶体金标记技术、与免疫学技术结合等 采用几种电镜技术观察病毒粒子的形态 Orf virus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎) Ebola virus埃博拉病毒（正染技术） Vaccinia virus 痘苗病毒 （投影技术） 负染技术 美国疾病控制和预防中心公布的一张未标明日期的彩色电子显微照片。它显示出H5N1型禽流感病毒（金黄色）在MDCK细胞（绿色）培养液中的活动状态 电镜技术的应用 研究病毒形态、鉴定 观察病毒的形态及形态发生学过程；亚显微结构；病毒与宿主细胞的关系；病毒感染细胞的超微结构改变；病毒的分类等。 诊断病毒病 检测不能在体外培养的病毒，如轮状病毒、星状病毒、嵌杯病毒、HAV等都是用电镜最先发现的——能进一步发现新的病毒和病毒病。 四、免疫学技术 1、病毒抗原 2、病毒抗体 3、免疫学诊断方法 免疫荧光法(IF) 免疫酶法（ELISA） 单克隆抗体技术 血凝抑制（HI）试验 血凝试验HA 琼脂扩散试验 五、分子生物学技术 核酸分子杂交技术 PCR技术 基因检测技术的应用 本章要点 病毒学研究的主要技术与原理 第八章  病毒学研究方法简介 生物安全实验室 P1实验室——研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松； P2实验室——