免疫共沉淀步骤.docVIP

. . 在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。 1.1.1 免疫沉淀 1）蛋白提取 （1）取10盘长满10 cm 大皿的Hep G2细胞，弃去培养基，用预冷PBS清洗细胞3次，吸净PBS残液。 （2）加预冷的裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）至培养皿中（每皿500-1000 ul），冰上孵育30 min。 （3）用细胞刮刮取，收集细胞裂解液并移至离心管，4℃离心13,000 g，10 min。 （4）将上清移至新离心管中，可用于蛋白浓度测定或远期研究。 2）准备磁珠 （1）将protein A和protein G珠子分别摇晃5 min混悬，各吸取50 ul珠子到1.5 ml EP管中，组成100 ul 珠子混合物。 （2）小离心机离心20-30 s，去上清。 3）结合抗体 （1）将肝细胞癌患者血清20 ul 和200 ul Ab Binding Washing Buffer 加入上述EP管中。 （2）室温旋转10 min孵育。 （3）小离心机离心20-30 s，去上清。 （4）加入200 ul Ab Binding Washing Buffer，轻柔吹打重悬珠子。 4）免疫沉淀 （1）将上述EP管离心，去上清。 （2）取5 ml蛋白裂解液轻柔吹打重悬珠子-抗体复合物。 （3）室温旋转孵育30 min（将抗原结合到珠子-抗体复合物上）。 （4）离心机离心20-30 s，将上清吸入干净离心管备用。 （5）使用200 ul Washing Buffer 清洗珠子-抗体-抗原复合物3次，即轻柔重悬、离心去上清3次。 （6）100 ul Washing Buffer 重悬珠子-抗体-抗原复合物，将混悬液移至干净EP管。 5）洗脱目的抗原 （1）将EP管离心，去上清。 （2）加20 uL Elution Buffer，轻柔吹悬复合物，避免产生气泡。 （3）室温旋转孵育2 min，分离复合物。 （4）EP管离心，将上清放吸入新EP管备用。 完成《WB实战指南》后，朋友曾央分享点免疫共沉淀方面的咚咚；当时不得不回绝。因为，WB指南是基于这些年的回复的汇总，基本上方方面面的问题都有提及，只需要做些串联；而论及coIP，目前在国内还不太普及，尽管它已经是生化领域最基本的技术之一。因此，再想写这么个长篇颇耗时间，于我的时间和精力太为难；不过，今天是个特殊的日子，凑凑热闹吧。——人，如果在某些方面成功了，必然在另外一面有亏欠，也许这就是上帝的公允吧。——在自己最擅长的地方找点成功的感觉吧，当然我的失败也只是因为没有更多的时间。。。哎！扯远了玩coIP也玩了5年多了，因为上手就是最难的B蛋白结合量多少的变化（假定IP A蛋白）而非检测B蛋白的有无，说句吹牛皮的话，在我们这个小领域三家最强的lab唯有我们敢于通篇基于这种检测手段，所以，对于coIP算是非常得有心得了。以下论述基于最难的B蛋白结合水平变化的检测，所以部分实验操作非常苛求；学会这个，其他就是小菜了；所以，这也算一个进阶篇。一.样品的制备。如《WB指南》，在这里我最强调从制备样品开始的一致性。如果不触及细胞的凋亡或死亡，那么任何处理组样品和ctrl最后的终体积应该保持一致；如果细胞有大量凋亡或死亡，可以通过比对标准体积对样品的体积粗略定量后再加裂解液，一般可以把误差控制在WB的检出范围以下，基本保持样品的均一；组织样品可以通过称重添加相应体积比的裂解液。裂解液的配方可以采用《WB指南》里给出的，原配方如下：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors（0.5M PMSF)此裂解缓冲液裂解条件相对温和，适合后续的coIP分析。“不过”用它做coIP有明显的缺陷；要理解此配方的缺陷，我们先聊聊如何在coIP实验中“作伪”。伪造结果，也分为单纯性造假和技术型伪造。撇去前者，从技巧上来讲，如果要想获得设定、预想的相互作用结果，可以从几个角度着手——此类结果可重复。a.在低盐离子裂解液中进行IP。很多蛋白复合体对盐浓度敏感，但敏感性有强弱之别。通常来说，真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐（0.15M）或更高浓度，即在生理盐浓度下不会解体。具体如，某种CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高盐而不