实验专题模块二基质金属明胶酶与肿瘤的关系-新版演示课件-精选.pptVIP

一、实验目的 掌握酶谱法测定MMP-2与MMP-9活性的原理 熟悉酶谱法操作技术 了解测定MMP-2与MMP-9活性的意义 实验 酶谱法分析食管癌中MMP-2与MMP-9活性 * 酶谱法是酶活性的测定方法之一。 酶活性的大小通常由酶降解底物的速度与程度决定。 酶谱法将酶的底物均匀地铺在聚丙烯酰胺凝胶内，先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后创造酶作用的适宜环境，使酶恢复活性，在凝胶上降解底物。该凝胶通过染色，可呈现酶作用的痕迹。比较不同样品该痕迹的大小，可知酶活性的差异。 二、背景与原理 * （一） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。 ν质点移动速度，q质点所带净电荷量，E为电场强度，r为质点半径，η为介质粘度。 * 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。过硫酸铵的催化作用需要TEMED的帮助。 + 催化剂 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰氨凝胶电泳 * 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶 对pH和温度变化较稳定 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率 聚丙烯酰胺凝胶特性 * 聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分子筛效应。蛋白质在该电泳中保持完整的状态，依三种因素分开：蛋白大小、形状和电荷。 * SDS，即十二烷基磺酸钠 SDS具有亲脂的长尾和亲水性头（带负电） SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构 给蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，因而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的相对分子质量大小 SDS及其作用 * SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳可用于测定相对分子质量大小 * 相对分子质量范围 适宜的凝胶浓度(%) 蛋 白 质 ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核 酸(DNA/RNA) ?104 15-20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 电泳时，需要注意凝胶网孔大小对分析的影响。凝胶浓度越大，网孔越小，影响大分子的移动；凝胶浓度越小网孔越大，对小分子的分子筛效应越小。 * 按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类： 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应分离。 不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度以及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 * 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1 电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液 2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素 不连续系统的特点： * “快慢离子”理论： 电泳开始时，样品在浓缩胶pH=6.8，甘氨酸电离较小，甘氨酸根离子带电最少，移动最慢，是“慢离子”。而HCl完全解离成氯离子，氯离子移动最快，是“快离子”。蛋白速度居中。 电泳开始后，氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 进入分离胶后，pH=8.8，甘氨酸电离完全，快慢离子层消失。 浓缩胶的作用是把加入的样品浓缩至一个狭窄的区带 * 天天好心情 天天好心情 天天好心情 天天好心情 天天好心情 天天好心情 天天好心情 天天好心情 天天好心情 天天好心情 天天好心情 天天好心情 天天好心情 天天