实验五 玉米种子盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定.pptVIP

实验五 玉米种子盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 目的要求 通过本实验，了解玉米种子盐溶蛋白的提取方法、电泳程序、染色和鉴别方法。 试液配制 凝胶溶液的配制 贮备液A（分离胶贮备液） 贮备液B（分离胶缓冲液） 贮备液C（分离胶化学聚合催化剂1%APS） 贮备液D（浓缩胶贮备液） 贮备液E（浓缩胶缓冲液） 贮备液F（浓缩胶聚合催化剂1%过硫酸铵） 贮备液G（凝胶聚合加速剂） 四甲基乙二胺（缩写TEMED） 凝胶溶液的配制 贮备液A（分离胶贮备液） 称取Acr90g和Bis3g，加入蒸馏水350ml，搅拌至完全溶解（约30min），并定容至500ml 过滤入棕色瓶中，放入冰箱低温保存。 凝胶溶液的配制 贮备液B（分离胶缓冲液） 吸取含量88%的甲酸0.427ml 再称取甲酸钠（含2个结晶水）1.0456g 加入50ml蒸馏水，搅拌混匀，并定容到100ml，并调节PH至3.2 倒入棕色瓶中，放入冰箱低温保存。 凝胶溶液的配制 贮备液C（分离胶化学聚合催化剂1%APS） 称取2gAPS，加入100ml蒸馏水，搅拌至完全溶解 再定容至200ml，倒入棕色瓶中 放入冰箱低温保存，仅能保存1周。 凝胶溶液的配制 贮备液D（浓缩胶贮备液） 称取9.3gAcr和0.31gBis，加入蒸馏水30ml，搅拌至完全溶解 并定容至50ml，倒入棕色瓶中 放入冰箱低温保存。 凝胶溶液的配制 贮备液E（浓缩胶缓冲液） 吸取含量为88%的甲酸0.218ml，称取甲酸钠0.5228g，加入30ml蒸馏水溶解，并定容至50ml 调节PH至5.6，倒入棕色瓶中 放入冰箱低温保存。 或者先溶解甲酸钠，然后用甲酸滴加，调节PH至5.6。 凝胶溶液的配制 贮备液F（浓缩胶聚合催化剂1%过硫酸铵） 称取1gAPS，先用60-70ml蒸馏水溶解，搅拌至完全溶解后 定容至100ml 倒入棕色瓶中，放入冰箱低温保存。 仅能保存1周。 凝胶溶液的配制 贮备液G（凝胶聚合加速剂） 四甲基乙二胺（缩写TEMED） 吸取TEMED 1ml，加蒸馏水9ml 定容至10ml 放入冰箱低温保存。 试液配制 样品提取液的配制 电极缓冲液的配制 蛋白质染色液配制 凝胶贮备液配制 样品提取液的配制 称取0.2928gNaCl，20g蔗糖和0.04g甲基绿，加蒸馏水溶解，充分搅拌至溶解 定容至100ml。 电极缓冲液的配制 吸取含量为88%的甲酸溶液8.54ml，称取甘氨酸6.006g，先用1600ml蒸馏水溶解，最后定容至2000ml 混匀并调节PH至3.45备用 可重复使用5次（或先将甘氨酸溶解，然后滴加甲酸，调至PH3.45） 蛋白质染色液配制 称取1g考马斯亮蓝R-250，先用95%酒精溶解至100ml，再配10%三氯醋酸溶液，然后吸取1%考马斯亮蓝3.5ml，再加10%TCA100ml，配成一块凝胶板染色液。 或者将考马斯亮蓝R-250配成0.5%（W/V）的乙醇溶液，用滤纸过滤，放入试剂瓶中备用。 另用蒸馏水配制10%（W/V）的三氯乙酸溶液。使用时，取5ml考马斯亮蓝R-250的乙醇溶液，加到200ml三氯乙酸溶液中，混匀 注：该染色液具有固定和染色两种功能，必须在放入凝胶染色前再混合。 操作技术 样品制备 取单粒玉米种子，在单粒样品磨上粉碎后，收集到1.5ml离心管中，按约1：1的量用洗瓶或滴管加入样品提取液，摇匀，自然沉降30min后，取上清液即可。 一般加样30-50ｕl,如加的提取液太少则可补加。 凝胶制备 电泳槽准备 先将玻璃装入橡胶封条中，然后插入有机玻璃制成的电泳槽中，拧紧螺栓，固定好胶模。 注意：玻璃板必须洗干净，而且要干燥，手指不能接触玻璃板表面，操作时用手拿住玻璃棱，另外，胶模在电泳槽中要放平，位置合适，以防漏水。 操作技术 操作技术 配胶 从冰箱中取出凝胶贮备液。 按表1比例取出一定体积的分离胶各贮备液混匀 同样取出浓缩胶溶液，混匀 G号液先不加入。 将各贮备液再放回冰箱。 贮备液编号 分离胶 浓缩胶 配比 一块板取液量 配比 一块板取液量 A 5 20ml B 1 4ml C 2 8ml D 1 1ml E 1 1ml F 2 2ml G 6ｕl 30ｕl 10ｕl 10ｕl 表1 凝胶配比 注意：取贮备液用的移液管要分别使用，不能混用。 操作技术 封底缝 灌制分离胶前必须先将底缝用胶封住 根据底缝大小，取10ml分离胶混合液，加入10ｕlG液（用微量注射器加入），然后迅速摇匀，沿下槽玻板外壁倒入，将底缝封住。 将电泳槽在实验台面上振动一下，使底缝封平。一般5~10min，分离胶就会将底缝封住。 操作技术 灌分离胶 从分离胶混合液中取出一块玻板的较量。 按比例加入G号溶液，迅速摇匀，将电泳槽倾斜，将分离胶混合液倒入