愈伤组织的诱导形成及分化.doc

第五章 愈伤组织的诱导、形成及分化 第一节 愈伤组织的诱导、形成及特点 一、愈伤组织的诱导和形成 愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的组织。经一段时间的生长和增殖以后，在其内部出现一定程度的分化，产生出一些具有分生组织结构的细胞团、色素细胞或管状分子。 植物外植体在培养基和外界环境的作用下，经过一个复杂的过程形成愈伤组织，即： 外植体＋培养基＋环境 愈伤组织 愈伤组织的形成一般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图4.1）。 图4.1 愈伤组织的形成特点 1. 诱导期 愈伤组织诱导期又称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂方向和代谢方式，合成代谢活动加强，大量合成蛋白质和核酸物质，为细胞分裂做准备。 诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素而异，即使是同一种物种不同基因型同一外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），而有的植物诱导期需要数天（胡萝卜）。刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h，但经贮藏5个月后，诱导期延长为2天。 2. 分裂期 外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发生分裂，细胞脱分化。愈伤组织的细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明（见图4.2）。分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。 小麦幼胚 分裂期 分裂期 分化期 分化期 图4.2 小麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期 （东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994） 愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和生理状况而有很大差异。烟草、胡萝卜等的脱分化很容易，而禾谷类则较难；花器官脱分化较易，茎叶较难；幼茎组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。 进入分裂期的愈伤组织，如仍在原来的培养基上继续培养，某些愈伤组织将不可避免地发生分化，产生新的结构，但将其及时转移到新鲜的培养基上（继代培养），则愈伤组织可无限制地进行细胞分裂增殖，维持不分化的状态。 3. 分化期 愈伤组织分化期，是指停止分裂的细胞发生生理生化代谢变化，形成由不同形态和功能细胞组成的愈伤组织。分化期细胞体积不再减少，最明显的特征是生长着的愈伤组织细胞的平均大小突然不再减少，而保持相对稳定。 愈伤组织分化期开始后，愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢直至停止，细胞分裂活动突然转向愈伤组织内部深处的局部地区，并改变分裂面方向，出现瘤状结构外表和内部分化（见图4.2）。此时，愈伤组织中出现瘤状结构的拟分生组织成为暂不再进一步分化的生长中心。分化的愈伤组织中有维管组织出现，但不形成维管系统，呈分散的节状和短束状结构。 二、愈伤组织的保持 1. 愈伤组织的颜色 外植体细胞经过诱导启动、分裂和分化等一系列变化后，形成无任何结构的愈伤组织。新鲜的愈伤组织颜色为奶黄色，也有白色且有光泽者，少数呈淡绿色。老化的愈伤组织则转变为黄色乃至褐色。 2. 愈伤组织的保持时间 愈伤组织在原来的培养基上保持一段时间后，由于培养基水分或营养物质的减少，以及愈伤组织本身分泌的代谢产物的不断积累，达到产生毒害的水平后，愈伤组织不再生长，如继续培养，愈伤组织开始老化，直至死亡。一般情况下，愈伤组织在原来的培养基上保持2～3周后，必须转移到新鲜的培养基上进行继代培养（Subculture）。继代培养的方法是将原来的愈伤组织分割成小块转移到新鲜的培养基上，用于继代培养的愈伤组织块必须达到一定的大小，一般直径为5 mm，重量约为100 mg，否则在新鲜的培养基上难以迅速恢复分裂和生长，或者生长十分缓慢。 应当注意的是，继代培养时愈伤组织不能硬性分割，因愈伤组织生长时有一个生长核心，一旦破坏，愈伤组织就难以恢复分裂和生长。因此，在分割愈伤组织时要根据具体情况，顺其自然进行分割，同时，还要选择新鲜健康的愈伤组织进行继代培养。 3. 愈伤组织的生长周期 愈伤组织自原来的培养基上转移到新鲜的培养基上3～7天即可恢复生长，随后2～3周内生长达到高峰，愈伤组织细胞分裂处于最活跃时期。到这一时期结束时，愈伤组织生长开始缓慢下来，此时愈伤组织体积达到最大。因此，通常在愈伤组织生长达到高峰前进行继代培养，这时愈伤组织中的细胞处于旺盛分裂状态，继代后有利于愈伤组织的恢复生长。否则，愈伤组织在停止生长较长一段时间后再转移到新鲜的培养基上，较难恢复细胞分裂。研究表明，24°C和弱光有利于愈伤组织的保存。据报道，大豆细胞系的愈伤组织在这种条件下可以保存 4. 拟分生组织 一般认为愈伤组织是无任何组织结构的细胞