临床微生物室抗生素敏感试验操作规程.docVIP

抗生素敏感试验操作规程 一、抗生素敏感试验原理: 抗生素敏感试验是测定抗生素或其它抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力，通常用扩散法或稀释法。 1、扩散法敏感试验: 有抗生素的纸片或药片贴在已接种试验菌的平板上，抗生素浓度梯度通过纸片上的抗生素的弥散作用而形成，距纸片一定范围内试验细菌的生长受到抑制，这种抑制生长与细菌敏感及其他诸因素相关。 2、稀释法敏感试验： 为了定量测定抗生素的活性，抗生素与肉汤或琼脂培养基混合进行稀释，然后种入试验细菌，孵育过夜，以最低浓度抑制细菌生长的，称为最低抑菌浓度（MIC），然后将最低抑菌浓度与机体血清或体液中可获得浓度相比较，来确定恰当的临床治疗浓度。 （1）最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration。MIC）:抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。单位：μg/ml或U/ml,mg/L。 （2）最低杀菌浓度（minimal bacteriacidal concentration，MBC）:抗菌药物杀灭细菌所需要的最低浓度。单位：μg/ml或U/ml，mg/L。 （3）MIC90：能抑制90%试验菌株的最低药物浓度，即为该药对被测菌的MIC90。 （4）MIC50：能抑制50%试验菌株的最低药物浓度，即为该药对被测菌的MIC50。 二、抗生素敏感试验的作用： 1、指导临床医生对各患者选择最佳抗生素。 2、在一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐药的微生物流行病学资料。 三、抗生素敏感试验的临床意义： 1、敏感：表示被测细菌引起的感染，除禁忌症外，可用该抗生素常用剂量而达到治疗的目的。 2、中介：表示被测菌株可通过提高剂量受到抑制，或在药物被生理性浓集的部位受到抑制，由于微小的技术因素失控可以对结果解释错误，所以这一范围只是抑菌环直径介于敏感和耐药之间的“缓冲域”抑菌环落入中介范围，其意义不明确，如果没有其他可以替代的药物，应重复或再以稀释法测定MIC。 3、耐药：被测菌不能被该抗生素的常用剂量在组织内或血液中的浓度达到抑制作用，而且不管其剂量大小或细菌所在部位。 四、常规药敏试验的药物选择 1、常规药敏试验一般只选择每一类抗生素中一种代表性药物，然后用代表性药物所获得的结果来推断整类药物的价值。（但并非绝对，有时也出现相反的结果） 2、头孢族抗生素可分四代，其第一代、第二代、第三代和第四代各有不同的抗菌谱，故每一亚类选其代表做常规测定。 3、临床微生物实验室，根据临床需要、细菌特性、临床药物学等多方面选择药物，进行药敏试验。 五、药敏试验方法（Kirby-Bauer法）： 1、试验材料： （1）培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂，该培养基具有对大多数细菌生长良好、不拮抗药物活性以及商品批间差小等优点。配制方法见培养基配制。 （2）药物纸片：直径为6.00～6.35mm,每片吸水量约20μl。 （3）质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853。测定M—H琼脂是否适合做磺胺类试验须用粪链球菌ATCC29212或33186，上述菌株可向卫生部或省临床检验中心购买。 质控菌株保存方法：将新得到的冻干菌株接种含血的M—H平板复活，然后每株细菌接种10支高层琼脂，放冰箱保存，每月取1支，传种细菌供常规使用，待用至最后1支再传代在M—H平板上接种一批高层琼脂备用。 （4）菌液比浊管：为保证药敏试验的准确度和精密度，必须对接种菌液的浓度做相应控制，采用比浊法来控制菌悬液浓度，接种浓度 1.5×108 ml，浊度相当于麦氏标准管第一号的1/2，比浊管配制方法如下： 0.048mol/L BaCl2 0.5ml和0.18mol/L H2SO4 99.5ml，将两液混合，置螺口试管中或普通试管玻璃纸加塞后，再用石蜡封住，放室温保存。用前混匀。有效期6个月。（相当于1/2号比浊管） 2、操作方法： （1）制备接种菌液：挑临床标本中分纯的菌落4～5个于M—H液体培养基中，置35℃水浴箱孵育4小时，校正浊度。或用接种环挑取菌落悬浮于生理盐水中，振荡混匀后与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管相同。 （2）接种平板：用无菌的棉试子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压去掉多余的菌液，用棉拭子涂布整个培养基表面，反复三次，每次将平板旋转60度，最后沿平板边缘绕两圈。 （3）贴纸片：须待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片，用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊子尖压一下，使其贴平，纸片一贴就不可再拿起，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平板边缘不少于15mm，直径为90mm的平板，贴纸片7张，贴好纸片后，须在15min内放培养箱，不可放CO2环境中。 （4）