结核病分子生物学与分子流行病学_合肥疾病预防控制中心.pptVIP

目前，培养的主要方法有：1、传统的改良罗氏培养基，需4-8W才能报告结果；2、快速液体培养，5-7天报告结果，可做药敏。 尽管结核杆菌不是作为传染源诊断的主要方法，但结果可信度高，是金标准，能做鉴定、药敏和分子检查。 什么情况下要做培养：1.涂阴要做鉴别诊断时，培养阳性可确诊为肺结核；2.抗结核治疗失败，要做培养进行菌型鉴定和药敏试验； * 我国是27个耐药结核病高负担国家之一，当前耐药结核病诊断主要依据DST，DST对有效化疗方案的建立和预后的预测具有重要意义，但有时DST与临床观察存在不一致性。 * 已细胞免疫为主，与其他感染性疾病一样，产生IgG、M;假阴性-抗原未包被、抗体滴度低、抗原抗体复合物；假阳性-BCG、隐形感染、交叉抗原。 * 20世纪70年代诞生的分枝杆菌快速培养和药敏检测技术，以BACTEC460为第一代检测系统，后期有了960和3D。 * BacT ALERT 3D 培养系统检测原理是其所用的培养瓶底部有顏色感应器，当分枝杆菌在培养瓶中生长，有C02产生时，顏色感应器由绿色变成黄色。仪器自动连续检测，检测的数据输入计算机，根据计算结果自动显示培养瓶中有无分支杆菌生长。结果3D系统 和常规培养法检测分支杆菌平均报告时间分别为11.7天、1和26.8天；其中涂阳标本平均时间为11天和29天，涂阴标本平均为21天和36天。 * * * 分子线性探针技术 ? 采用线性探针技术（Line-Probe或称DNA-Strip）检测结核分枝杆菌复合群利福平(rpoB)和异烟肼(katG和inhA)耐药基因 ? 检测rpoB基因的常见突变位置 (coding for the α-subunit of the RNA polymerase)来判断利福平耐药性 ? 检测KatG基因(coding for the catalase peroxidase)及inhA基因(coding for the NADH enoyl ACP reductase)来判断异烟肼耐药性 ? 利福平：rpoB基因 编码结核分枝杆菌RNA聚合酶β亚单位 利福平耐药的90~95%由该基因突变引起 集中于509~533的利福平耐药决定区 ? 常见突变位点及频率从高至低依次为： 531位、526位、516位、513位、533位 ? GenoType? MTBDRplus检测： 1.野生型位点: WT1~WT8 2.耐药突变位点: 531、526A、526B、516 ? ? 异烟肼：katG和inhA基因 katG基因：编码触酶-过氧化物酶 40-100%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为高水平耐药 ? inhA基因：编码NADH烯酰基ACP还原酶 25%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为低水平耐药 ? GenoType? MTBDRplus检测： katG基因： 1个野生型位点： 2个耐药突变位点： ? inhA基因: 2个野生型位点： 4个耐药突变位点： ? Hian 检测步骤 Hian 检测步骤 Hian 检测步骤 DNA提取 标本 固体或液体培养基培养的菌种 抗酸染色涂片阳性标本 方法 超声波裂解： GenoLyse试剂盒： Hian 检测步骤 PCR扩增 1.不同标本,扩增参数不同 培养菌种：扩增20个循环 涂阳标本：扩增30个循环 2.引物：生物素标记 3.多重PCR扩增 Hian 检测步骤 杂 交 采用反向杂交法 PCR扩增产物→变性（DNA成单链）→与线性探针杂交→洗涤→显色→判断结果 ? 杂交试剂 解链 - ssDNA 扩增产物-探针杂交 严格漂洗 DNA-strip显色 ? ? 结果判读 GenoType? MTBDRplus的反应区 野生型：有杂交带显色为?°+?±，表示未发生突变 ? ? 耐药突变位点：有杂交带显色为?°+?±，表示发生突变 ? 敏感：所有野生型探针“+”和所有耐药位点探针“—” ? 耐药：对应药物有1条野生型探针“—”或有1条耐药位点“+” ? 山东胸科医院11月2日培训结果 山东胸科医院11月2日培训结果 ? ? WHO在南非、印度及俄罗斯这些TB高发区，展示分子线性探针跟传统培养对比，涂阳标本的灵敏度和特异性高于97%和98%，肯定了分子线性探针技术快速检测高度可疑MDR-TB病人的价值。 分子线性探针未能完全取代传统培养，特别是涂阴标本必须做培养，但这个新技术缩短了等候的时间及省略了繁琐的操作。 * * * 核酸探针 ??? 核酸探针(nuclear acid Probe)