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基因检测常用技术 检测技术的发展 基因组DNA的基本结构与化学组成 第一代诊断技术- 限制性片段长度多态性检测（RFLP） 限制性核酸内切酶:识别和切割特异DNA序列； 限制性位点 第一代诊断技术- Southern杂交 DNA-DNA杂交： Southern杂交基本步骤 第一代诊断技术- DNA体外扩增技术 聚合酶链反应（PCR） PCR的特点 检材要求低 操作简便 灵敏度高 特异性较好 PCR的问题 易污染 定量困难 人为因素影响 PCR技术出现的背景 1955年发现?DNA?polymerase?I； 70年代的初期发现具有实验价值及可得性Klenow?fragment 1971年Dr.?Kjell?Kleppe?提出类似基因修复复制?的PCR原始雏形概念； 1976年从热泉的细菌(Thermus?Aquaticus)?中分离出能耐高温 Taq?polymerase； 1983年Dr.?Kary?B.?Mullis发展出PCR技术，1985年正式发表了第一篇相关的论文。 1989?年，PCR被列为年度的重要科学发明产物。 PCR 反应参数 预变性：94℃下预变性5-10min，使模板DNA 完全解链。减少非特异性配对的引物与模板复合物形成。 循环中的变性：一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。扩增片段GC含量的差异是变性温度选定的主要依据， GC含量高则应相应提高变性温度，反之亦然，但一般不应低于90℃。应注意变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。 循环中的复性（退火）：PCR 的一个关键参数，在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。如何解决这个矛盾？合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm[4X（C+G）+2X（A+T）或软件计算] 低5℃,当产物中出现影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。退火温度越高,所得产物的特异性越高。 当多重PCR扩增各引物对Tm值出现差异时，如何初步确定退火温度？一是将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃；二是根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。 当退火温度较高以致接近延伸温度时，如何设定PCR参数？将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。 退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度，因此…… 循环中的延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。 循环次数 ：循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。 如经25-30 轮循环扩增后,产物量仍不够 怎么办？一是增加模板量重新扩增；二是将扩增的DNA 样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60 轮循环后, 扩增水平可达109-1010。 扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。其中：C 为扩增产物量,C0 为起始DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。 在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应？，减少非特异性产物。 PCR反应体系的组成与作用 引用《分子克隆3》提供的PCR 标准反应条件： 模板 1pg-1μg 引物 1μmol/L DNA 聚合酶1－5 单位 Mg2＋ 1.5mmol/L dNTPs 200μmol/L each KCl 50 mmol/L 模 板 模板的质量是PCR 成功的先决条件，PCR失败首先要考虑模板问题。 所需的最佳模板量取决于基因