CLSI临床质谱新标准解读.docVIP

. . . . .下载可编辑. CLSI 临床质谱标准 C62-A新内容解读 CLSI 临床质谱标准C62-A主题内容架构由基础内容部分包括（1）范围、（2）标准预防措施、（3）术语、（4）仪器；方法内容包括（5）预考察事项、（6）方法建立、（7）方法验证；质控内容包括（8）液质检验方法的质量保证与质量控制、（9）后续监督构成。其中方法和质控内容是与应用过程直接相关的。下面进行具体介绍。 5．预考察事项（preexamination considerations） 5.1目标分析物 内容包括5.1.1 外源性物质、5.1.2内源性物质、5.1.3 外源性和内源性物质的相关因素、5.1.4 样本采集。要充分了解目标分析物的性质，包含（1）目标分析物的临床意义如生理意义、临床价值、常用检测方法等；（2）理化性质如结构式、分子量、沸点、极性大小、酸碱性等；（3）存在形式如游离型、结合型；（4）干扰因素如类似物、同分异构体、其他代谢产物等；（5）预期浓度如常量级、微量级、参考区间浓度、切点浓度、病理浓度等；（6）样本类型如血清、血浆、全血、尿样、唾液、胆汁、组织等；（7）采集和处理方式如静脉血、足底血、指尖血、离心处理或静置、何种采血管等；（8）储存和运输方式如避光、冷藏、冷冻等。 5.2 内标 内标可以校正基质效应或者样本萃取、色谱分离、离子化过程中产生的偏差，有利于提高定量分析的准确性和精密度及方法稳定性。 5.3 试剂和耗材的质量 5.3.1 试剂盒耗材的质量：由于MS灵敏度高，因此试剂和耗材要求也高。在使用前应对试剂、耗材进行验证，避免其中杂质对MS的影响。使用过程中应按照SOP进行保存、操作，避免污染。按照ISO 17025:2017进行批间次管控。 5.3.2 实验室设备：配置校准品和内标时，实验室应使用A级的容量瓶和移液器。 6．方法建立（assay development） 6.1离子转变（ion transition） 在建立和优化质谱采集参数的过程中，要先配制标准物质溶液直接导入质谱检测器进行质谱扫描，获取目标化合物的相关信息。根据目标分析物的极性选择合适的离子化方式：ESI源适合中等偏大极性化合物、难挥发化合物或热不稳定化合物；APCI源适合有一定挥发性的中等极性或低极性的小分子化合物。根据化合物的功能基团选择正负离子模式，然后选择合适的离子对分别作为定量离子对和定性离子对。之后，优化化合物参数，包括离子源参数以及质谱扫描参数，使所选择的离子对质谱响应值最高。 6.2高效液相色谱固定相 色谱柱种类繁杂，色谱柱选择通常取决于目标分析物的元素组成和化学结构。弱极性固定相有C18、C8、苯基柱等，极性固定相有氨基柱、氰基柱、硅胶柱等。要注意色谱柱的耐压范围和pH使用范围。当更换色谱组时，应使用系统适用性样本（SSS）进行核查。 6.3高效液相色谱流动相 流动相的设计取决于目标分析物的理化性质和色谱柱的特性。影响分离效果的流动相参数包括溶剂组成和比例、流速、离子强度、pH值、添加剂和温度等。其中避免使用的添加剂有非挥发盐、无机盐（腐蚀离子源）、表面活性剂（抑制电喷雾）、离子对试剂（影响后续离子化）。进行梯度洗脱或等度洗脱时，要注意溶剂比例、进样量、运行时间、梯度范围、柱温、样品溶剂等因素对分析结果的影响。应明确标注流动相的有效期。 6.4参数考察（examination variables） 6.4.1保留时间 控制流动相、色谱柱及外部条件（如温度）等。要预混合、防蒸发、控制pH值、保证泵流速。要求每次检测保留时间变化在±2.5%内。 6.4.2色谱分辨率 应达到基线分离Rs1.25。可以通过增加色谱柱长度、改变流动相组成和比例、减缓梯度、降低流速和提高柱温来实现良好的色谱分离。 6.4.3其他改善色谱质量的因素如使用保护柱、减少死体积、检查管线连接到位等。 6.4.4信噪比 LLMI处S/N至少大于10，建议大于20。改善S/N的措施有考察基质效应、再优化提取效率、离子源参数、洗脱梯度、重组溶液、进样体积，优化驻留时间，优化进样量，优化前处理以及考虑衍生。 6.4.5色谱峰数据点和积分 推荐15-20个数据点，定量项目最低不少于10个数据点进行拟合。采集数据点的个数应与驻留时间有关。采用正切斜滑（tangent skim）方式积分非基线分离色谱峰。 6.5误差来源 6.5.1由基质效应引起 生物样本高度复杂，基质组成一般包括盐类、脂类、蛋白、多肽有机小分子等。盐类、脂类（特别是磷脂）是离子化效率最重要的影响因素。多数基质干扰可以通过样品前处理或色谱分离去除。 6.5.2碎片离子的交叉干扰 如果两个碎片离子有相同的m/z，并且同时进入