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第七 章 重组体克隆的筛选和鉴定p205第一节 载体表型选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法1. 原理：pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I; Ampr上有插入位点Pst I。2. pBR322抗菌素标记选择（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。（2）氨苄青霉素抗性基因：产生?-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。BamH I在Tc抗性基因上转化处理受体菌 AmpAmp正选择负选择Tc3. 选择过程：（1）四环素抗性插入失活如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法+半乳糖葡萄糖乳糖?-半乳糖苷酶+5-溴-4-氯靛蓝半乳糖Xgal深蓝色1. 原理：载体上有一段?-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的?片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的?-半乳糖苷酶基因（ ?片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的?-半乳糖苷酶。2. 选择过程?-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。第二节 根据插入基因的表型选择利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。一、原理：1.弥补缺陷转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。受体菌：his-在不含组氨酸的培养基中生长外源基因：his+2. 增加新性状使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。例：小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板DHFR转化受体菌连接载体含DHFR的克隆才能生长第三节 DNA电泳检测法 利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。重组克隆分子量Marker载体二、酶切电泳筛选法1. 原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。ABA或B不同克隆的酶切结果筛选过程三、PCR扩增检测法1. 原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。2. 过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。第四节 核酸杂交检测法P107一、原理：1. 核酸杂交重组克隆与探针杂交。2. 检测用的探针与外源DNA插入片断互补的序列。3. 识别标记（1）放射性同位素32P 或 125I 。（2）非放射性标记荧光素二、核酸杂交检测方法1. Southern blotting用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。Southern blottingSouthern blot 筛选结果（1）菌落杂交P109特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。（2）R-环检测法1）原理：DNA-RNA杂交。2）选择过程用外源基因的mRNA与重组载体杂交。在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。缺点：需要电镜！2. Northern blotting用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。主要检测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。第五节 免疫化学检测法 P206对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。一、放射性抗体检测法二、免疫沉淀检测法三、酶联免疫吸附测定（ELISA）四、免疫印迹（western blotting）法一、放射性抗体检测法1. 抗体与产物的结合方式根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜125I 标记的二抗结合蛋白待测基因产物蛋白一抗二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标记的二抗125I