9经典免疫学试验沉淀反应.pptxVIP

;第十三章 沉淀反应;;返回总目录; 根据沉淀反应的介质和检测方法的不同, 沉淀反应可分为: 液相内的沉淀反应 凝胶内的沉淀反应;第一节 液体内沉淀试验 根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分为三类： 絮状沉淀 环状沉淀 免疫浊度沉淀;一、絮状沉淀试验 絮状沉淀试验是一项经典实验技术。曾用于测定梅毒抗体的Kahn试验是絮状沉淀的代表试验，现今已被更简便而敏感的USR或RPR方法替代。;;(二) 操作步骤 1. 抗原稀释法 (1) 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 (2) ???管加入一定浓度的适量抗血清。 (3) 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。 (4) 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。;2. 抗体稀释法 本法采用抗原量恒定与不同倍比稀释度的抗体反应，出现沉淀物最多的管为抗体最适比例管。 3. 方阵滴定法 抗原和抗体同时稀释，亦称棋盘(checkerboard)滴定法，是前二法的结合，可一次完成抗原和抗体的滴定并找出抗原、抗体的最适比。 ;(三) 方法评价 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。 ;二、环状沉淀试验 环状沉淀(ring precipitation)试验是由Ascoli于1902年建立的一种经典的血清学定性试验。用非常简便的技术了解待测血清内是否存在某种抗原或抗体。;(一) 原理 把抗原溶液小心地加于已含抗体溶液的细试管液面上。当对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳白色沉淀环。 ;(二) 操作步骤 1. 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管(内径 约1.5~2mm)底部，避免产生气泡。 2. 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。 3. 置沉淀管于室温下使其反应，1~5min内 在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。;(三) 方法评价 该试验是经典的血清学反应之一，简便、快速、实用。故用于鉴定血迹和诊断炭疽(Ascoli试验)。只能定性，不能定量、敏感性较低(3~20mg/L)，对含有多个抗原抗体对的反应系统缺乏分辨力。方法难以推广。 ; 三、免疫浊度试验 经典的免疫沉淀试验是抗原和相应抗体在反应终点时判定结果，方法存在耗时、敏感度低(10~100mg/L)和不能自动化等缺点。70年代以来，根据抗原和抗体所在液相内快速结合并产生浊度的原理，建立了免疫比浊法。临床常用3种微量免疫技术，即透射比浊法、散射比浊法和免疫胶乳比浊法，借助多种自动化分析仪器来完成。;(一) 透射比浊法 1. 原理 抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。;2. 操作步骤 (1) 用稀释缓冲液将待检样品和标准品按规定稀释，取一定量加至测定管中。 (2) 加最适工作浓度(用方阵法预先滴定)的抗体，孵育一定时间，测定吸光度(A)值。 (3) 以不同浓度抗原含量为横轴，吸光度为纵轴，绘标准曲线。从标准曲线可得待检抗原量。 ;;(二) 散射比浊法 散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法和终点散射比浊法。;;;(3) 方法评价： 检测不必等到抗原抗体反应达到平衡，大大节约反应时间，每小时可检测数十份标本，敏感度高，最小检出量达μg/L水平。 ;2. 终点散射比浊法 (1) 原理： 让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡后，测定其复合物的量。复合物的浊度不再受时间的影响，但反应复合物聚合产生絮状沉淀之前(大约反应数十分钟)进行浊度测定。 ;(2) 操作步骤 1) 用稀释液稀释待检抗原和抗原标准品。 2) 取一定量稀释待检抗原液和不同浓度抗原标准品溶液加至试管中，加抗体充分混匀，孵育一定时间，比浊。 3) 以抗原标准品量为横坐标，浊度值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待检抗原的浊度值，查出抗原含量。;;;2. 操作步骤 1) 用稀释液将待测抗原和抗原标准品稀释。 2) 将抗体致敏胶乳溶液和待测抗原、不同浓度的抗原标准品反应一段时间，测吸光度值。 3) 以抗原标准