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免疫学检验第十三章 沉淀反应可溶性抗原+相应抗体 肉眼可见的沉淀目　录 1897年 Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应抗血清混合出现沉淀1905年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行1946年 Oudin 报告了试管免疫扩散技术1965年 Mancini 提出单向免疫扩散技术，使定性免疫试验向定量化发展免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微量、自动化的新阶段。返回总目录 根据沉淀反应的介质和检测方法的不同,沉淀反应可分为: 液相内的沉淀反应 凝胶内的沉淀反应第一节 液体内沉淀试验 根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分为三类： 絮状沉淀 环状沉淀 免疫浊度沉淀一、絮状沉淀试验 絮状沉淀试验是一项经典实验技术。曾用于测定梅毒抗体的Kahn试验是絮状沉淀的代表试验，现今已被更简便而敏感的USR或RPR方法替代。(一) 原理 抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。絮状沉淀易受抗原与抗体比例的影响，由此可作为最适比测定的基本方法。(二) 操作步骤1. 抗原稀释法(1) 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。(2) 各管加入一定浓度的适量抗血清。(3) 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。(4) 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。2. 抗体稀释法 本法采用抗原量恒定与不同倍比稀释度的抗体反应，出现沉淀物最多的管为抗体最适比例管。3. 方阵滴定法 抗原和抗体同时稀释，亦称棋盘(checkerboard)滴定法，是前二法的结合，可一次完成抗原和抗体的滴定并找出抗原、抗体的最适比。(三) 方法评价絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。 二、环状沉淀试验 环状沉淀(ring precipitation)试验是由Ascoli于1902年建立的一种经典的血清学定性试验。用非常简便的技术了解待测血清内是否存在某种抗原或抗体。(一) 原理把抗原溶液小心地加于已含抗体溶液的细试管液面上。当对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳白色沉淀环。 (二) 操作步骤1. 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管(内径 约1.5~2mm)底部，避免产生气泡。2. 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。3. 置沉淀管于室温下使其反应，1~5min内 在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。(三) 方法评价 该试验是经典的血清学反应之一，简便、快速、实用。故用于鉴定血迹和诊断炭疽(Ascoli试验)。只能定性，不能定量、敏感性较低(3~20mg/L)，对含有多个抗原抗体对的反应系统缺乏分辨力。方法难以推广。 三、免疫浊度试验 经典的免疫沉淀试验是抗原和相应抗体在反应终点时判定结果，方法存在耗时、敏感度低(10~100mg/L)和不能自动化等缺点。70年代以来，根据抗原和抗体所在液相内快速结合并产生浊度的原理，建立了免疫比浊法。临床常用3种微量免疫技术，即透射比浊法、散射比浊法和免疫胶乳比浊法，借助多种自动化分析仪器来完成。(一) 透射比浊法1. 原理 抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。2. 操作步骤(1) 用稀释缓冲液将待检样品和标准品按规定稀释，取一定量加至测定管中。(2) 加最适工作浓度(用方阵法预先滴定)的抗体，孵育一定时间，测定吸光度(A)值。(3) 以不同浓度抗原含量为横轴，吸光度为纵轴，绘标准曲线。从标准曲线可得待检抗原量。3. 方法评价 敏感度高于单相琼脂扩散试验5~10倍，批内、批间重复性较好，变异系数10%，操作简便快速，1h可报告结果。(二) 散射比浊法散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法和终点散射比浊法。1. 速率散射比浊法(1) 原理：是一种抗原抗体结合动态测定法。所谓速率是抗原抗体结合反应过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率法是测定最大反应速率，即在抗原抗体反应达最高峰时，通常为数十秒钟，测定其复合物形成的量。峰值的高低在抗体过量情况下与抗原的量成正比。峰值出现的时间与抗体的浓度及其亲