(整理)包涵体的分离纯化..pdf

精品文档 包涵体的纯化和复性总结（二） 关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题， 包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈， 关于包 涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比 较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1. 高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液， 放置于筒内约 1/3 体积， 盖紧筒盖，将调速器先拨 至最慢处， 开动开关后， 逐步加速至所需速度。 此法适用于动物内脏组织、 植物肉质种子等。 2. 玻璃匀浆器匀浆： 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨， 上下移动， 即可将细 胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3. 超声波处理法： 用一定功率的超声波处理细胞悬液， 使细胞急剧震荡破裂， 此法多适用于 微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用 50-100 毫克菌体 / 毫升浓度，在 1KG至 10KG 频率下处理 10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施， 时间以及超声间歇时间、 超声时间可以自己调整， 超声完全了菌液应该变清亮， 如果不放心 可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4. 反复冻融法：将细胞在 -20 度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩 余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5. 化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（ SDS）、去氧胆酸钠 等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为 1mg/ml。 无论用哪一种方法破碎组织细胞， 都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中， 使大分 子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（ DFP）可以抑制或减慢自溶作 用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性， 加入苯甲磺酰氟化 物 （PMSF）也能清除蛋白水解酶活力， 但不是全部， 而且应该在破碎的同时多加几次； 另外， 还可通过选择 pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方 : 裂解液： 50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-1 00, 1mg/ml 溶菌酶。 ( 溶菌酶在这个 pH 范围内比较好发挥作用 ) 但我个人的经验是 : 如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话 , 而且蛋白的分子量又小于 20kd 的 话, 尽量减少溶菌酶的用量 , 会引入溶菌酶这种杂蛋白 . 一般配 60ml 裂解液用药匙匙柄盛一 点就够 . 判断裂解好坏的标准是 , 溶液很粘 . protocol 是 10ml-50ml 缓冲液 ( 菌体洗涤液 , 裂解液等 )/1g 湿菌体 . 如果只做一个鉴定 , 我觉得 100-200ml 菌就够了 . 但凡超声 , 我都用 60ml 裂解液 , 因为我们的超声仪 ( 现代分子生物学实验技术录象里的那种 ) 很适合用 100ml 小烧杯 , 装 60ml 裂解液 , 这样能让超声头离液面不高不低 , 不会冒泡泡 , 也不 会洒出来 . 菌多我就延长超声时间 . 沉淀 , 也就是包涵体沉淀了 , 如果要上柱纯化 , 一定要先用 4M尿素洗涤一下再用 8M尿素溶解 .