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精品课件 * 启动子区甲基化芯片技术 精品课件 * 精品课件 * 精品课件 * 精品课件 * 精品课件 * Base-Specific Cleavage 精品课件 * Primer Extension Methods 精品课件 * 精品课件 * 精品课件 * 应用二： 重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-sequence PCR，BSP) 精品课件 * 精品课件 * 注： A：癌组织；B：癌旁组织；○-：未甲基化；●：甲基化 43A 43B M 43AE 43A 43BE 43B (369bp) 43B BSP克隆测序结果 精品课件 * BSP克隆测序甲基化率三维图形 精品课件 * 优点:能准确的检测出每个DNA分子单倍体型的 甲基化状态，同时能分析不同CpG位点之间 的甲基化状态的联系。 缺点：需要对PCR产物克隆，操作繁琐，费时费 力，克隆子的数目影响结果的准确性。 测序重复性差。 精品课件 * 应用三： 甲基化特异性PCR (methylafion-specific PCR，MS-PCR) 精品课件 * 精品课件 * 精品课件 * U M U M U M ladder 100 150 200 250 MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化 图 MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片 甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。 精品课件 * MSP扩增产物凝胶电泳图 研究结果 注：M表示 甲基化，U表示未甲基化 B1-B6为高脂血症组六例标本，D1-D5为正常对照组五例标本； H2O为阴性对照；m为50bpMarker。 SREBP-1基因启动子区CpG岛甲基化状态 精品课件 * 优点： ①操作简便；②敏感性高；③Nested-MSP提高灵敏度，便于分析微量检材 缺点： ①引物设计要求高； ②只能作定性研究； ③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性； ④只能了解部分位点的甲基化状态。 精品课件 * 对MSP的产物用Taqman探针进行qPCR，从而 实现甲基化的定量分析。 优点：增加了重亚硫酸盐转化和DNA复性的质控对照 避免了电泳、酶切等操作 缺点：PCR bias 精品课件 * 应用四：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA) 精品课件 * 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 精品课件 * 甲基化特异性的限制性内切酶(MDRE)： 可以识别甲基化的胞嘧啶 甲基化敏感性的限制性内切酶(MSRE)： 可以识别甲基化的胞嘧啶 精品课件 * 精品课件 * 图 1-1 MSRE-PCR原理图 注：左图DNA无甲基化, DNA被切断, 无法得到PCR产物; 右图DNA有甲基化, DNA保持完整,可以获得PCR产物. 精品课件 * 采用甲基化敏感性限制性内切酶技术结合PCR的方法（MSRE-PCR）筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化差异的基因。 精品课件 * 图1-3：DNM基因琼脂糖凝胶电泳图 M 21AE 17B 17BE 17A 17AE 21A 空 21B 21BE 100bp 250bp 150bp 400bp 500bp 注：M：Marker；E：加酶体系；A：癌组织；B：癌旁组织；空：水空白 精品课件 * 酶识别位点内含有一个及以上CpG位点 应用条件： 精品课件 * 优点： ①方法相对简单； ②可进行甲基化水平的定量研究； ③需要样本量少。 精品课件 * 缺点： ①由于CG仅限于内切酶识别序列中，因此非识别序列的CG将被忽略； ②只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义； ④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题； 精品课件 * 应用五： Restriction Digestion and Real-Time PCR(qAMP) 精品课件 * 基本步骤 精品课件 * 举例：The evalution of differentially methylated region(MDR) of imprinted gene U2af1-rs1,in testis and liver of mouse Primer are designed to flank Notl(N),Hhal(Hh),and McrBc(M) Restriction sites in the DMR region. 精