QPCR技术细节《精选》.pptVIP

将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT) 原始图谱 对数图谱 SYBR Green I染料法——融解曲线 5 融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 SYBR Green I染料法——融解曲线 5 对DNA模板没有选择性 使用方便，不必设计复杂探针 具有价格优势 优 点 容易产生假阳性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 缺 点 SYBR Green I染料法——优缺点 5 Taqman探针法——原理 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 5 Taqman探针法——工作机理 热变性 引物和探针与模板退火 延伸反应 探针 报告基团 淬灭基团 探针 DNA聚合酶 引物 R R R R 5 1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的确定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同 Taqman探针法——PCR体系的建立 5 3’淬灭基团 淬灭基团性质 建议使用的5’报告基团 TAMRA 荧光物质 FAM, HEX, TET, JOE等 Eclipse 非荧光物质 FAM, HEX, TET, JOE, TAMRA, ROX等 Taqman探针法——荧光标记物的选择 5 高度特异性 重复性好 可进行多重定量 优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针 缺 点 Taqman探针法——优缺点 5 不同定量方法的比较 方法 优点 缺点 适用范围 SYBR Green I 方法 适用性广 灵敏 方便 便宜 引物要求高 易出现非特异性带 不能进行多重定量 适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究 TaqMan 方法 特异性高 重复性好 多重定量 价格高 只适合特定目标 病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核 遗传疾病的诊断 5 荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 实验流程及注意事项 荧光定量PCR解析方法 5 SYBR法实验流程及注意事项 样品制备 模板准备 引物设计 反应条件优化 浓度确定 技能要求 环境要求 误差控制 数据分析 仪器软件 RT 上机 反应体系优化 试剂选择 分析方法 5 样品制备 环境要求 模板准备 数据分析 RT 上机 浓度确定 SYBR法实验流程及注意事项 无RNase环境 使用无RNase耗材 专用RNase-free工具 高纯度，浓度均一的RNA 分光光度计检测 电泳检测 5 RT 反应体系优化 试剂选择 样品制备 模板准备 数据分析 上机 AMV M-MLV Quant Super 下游反应数确定反转录体积 选择应用引物 高效、全长的cDNA SYBR法实验流程及注意事项 5 模板准备 引物设计 浓度确定 环境要求 误差控制 RT 样品制备 数据分析 上机 核酸制备区 反应液制备区 制作标准曲线 设定浓度区间 评价引物 使用mix降低系统误差 设置重复（≥3次） 设置空白和阴性对照 均一的反应液和模板混合物 GC％：50－60％ Tm：55－60℃ 单个碱基重复＜4个 无二级结构 扩增长度：50－150bp 引物位置 5 反应体系优化 上机 反应条件优化 RT 样品制备 模板准备 数据分析 反应体积＞5ul，推荐20－50ul Mg2＋调节，酶活调节 引物浓度优化，模板量优化 退火温度优化：梯度PCR 延伸时间：产物长度决定 扩增效率：90％－110％ 重复性：std＜0.2 标准曲线：R＞0.99或R2 ＞0.98 SYBR法实验流程及注意事项 标准品 待测样本 阳性对照 阴性对照 5 技能要求 误差控制 上机 试剂选择 RT 样品制备 模板准备 数据分析 自配 DBI Real mastermix Roche-Lightcycler ser