实验二叶绿体的分离与荧光观察.pptxVIP

实验二;;实验原理;常用的细胞破碎方法;离心分离技术;差速离心;密度梯度离心;速率-区带梯度离心和等密度梯度离心;两种密度梯度离心方法的异同;表1:各种亚细胞构造在不同的离心介质中分离所需的离心力与时间;各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数;离心力与离心机转速转换公式：;荧光;1.两组光源:透射照明光源(卤素灯)；荧光光源(超高压直流汞灯或氙灯)； 2.有特殊的滤光片:激发滤色片和阻断滤片 3.激发光波长：较短，因此，分辨力高于普通显微镜； 4.荧光光源照明方式：通???为落射式。;荧光染料:吖啶橙(acridine orange );加入吖啶橙后叶绿体的自发荧光（火红色）消失了？ 原因：是荧光淬灭现象所致。吖啶橙是一种芳香杂环阳离子型染料，可透过细胞膜，因此而推测吖啶橙阳离子是进入叶绿体膜内通过影响叶绿素分子的结构或所处的化学环境使自发荧光淬灭的。; 实验用品;菠菜叶片(去叶脉)3g → 0.35mol/L氯化钠15ml→研磨(冰浴)→匀浆过滤(2层尼龙网)→滤液在1000rpm离心2min→弃沉淀，上清液3000rpm离心5min →去上清液→沉淀为叶绿体(混有部分细胞核)，用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮 →滴片观察 取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用普通光学显微镜观察叶绿体的形态结构和荧光显微镜观察自发荧光 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片,使用荧光显微镜观察间接荧光 取叶表皮临时装片荧光染色观察 ;;;叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 离心机使用：离心管要平衡 荧光显微镜使用 荧光显微镜检要在光线尽量暗的环境下进行 使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛 凡是荧光染料都有一定毒性，请做好防护 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等 在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。 在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 汞灯开启后15min内不要关闭;记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象，并分析结果，解释叶绿体发出的自发荧光和次生荧光的作用机理有何不同？;思考题