第九周 2014-4-22 上课分子生物学研究方法.ppt

3)基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 法医学分析 个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 5.5 RNA 干扰 RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象。 由于RNAi可以作为一种简单、有效的基因沉默工具，因而在医药开发、基因治疗和功能基因组研究等方面的应用得到飞速发展。 一、RNAi现象的发现； 二、RNAi的基本原理； 三、RNAi技术的应用。 主要内容 RNAi是后基因组时代非常重要的研究工具。 2006年的诺贝尔生理学奖获得者： Andrew Z. Fire Craig C. Mello 二、RNAi的基本原理 RNAi是一个依赖ATP的过程，一种称为Dicer的核酸酶负责将dsRNA酶切转化为3’端有2～3nt突出、长21～23bp 的小分子双链RNA ，这种RNA称为小干扰RNA（siRNA）。siRNA形成之后，与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体(RISC)，此复合物通过碱基互补配对识别靶mRNA 并使其降解，从而导致特定基因沉默。 靶基因mRNA siRNA的反义链 RNAi是生物体抵御外源遗传物质入侵的自我 保护机制。 mRNA被酶切破坏，性状无法表达。 三、RNAi技术的应用 （一）.功能基因组的研究； （二）.疾病治疗； （一）.功能基因组的研究 随着一些物种基因组计划的完成，科学家急需一种新的、快速的方法解读基因的功能和基因的表达机制以及基因之间的相互关系。而RNAi技术已成为解决这些问题的重要手段。 与其他方法相比，RNAi具有其独特的优点：①简单易行，容易开展；②与基因敲除相比实验周期短，成本低；③与反义技术相比具有高度特异性和高效性；④可进行高通量基因功能分析。 总之, 随着后基因组学时代的到来，RNAi技术将会成为功能基因组学研究的主要方法。 线虫：选取2500个基因进行RNAi实验，观察线虫的发育。发现700个基因的RNAi可导致胚胎致死，胚胎后致死，不育及形态异常等表型。 线虫基因组范围内高通量RNAi （二）.疾病治疗 RNAi可以直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的。 在治疗病毒性疾病的研究中，可以设计针对病毒基因组RNA的siRNA或针对宿主细胞病毒受体的siRNA来抗病毒，目前针对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、呼吸道合胞体病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、 HIV-1等均取得了令人欣喜的体外病毒抑制作用。 5.4 核酸杂交技术 （一）Southern Blot （二）Northern Blot 5.4 核酸杂交技术 （一）Southern Blot 原理： 将待检测的DNA分子经限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测DNA样品中的基因及其含量等。 Southern Blot 操作步骤： DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测RNA样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 （二）Northern Blot 操作过程 mRNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光 5.4 核酸杂交技术 （一）Southern Blot （二）Northern Blot 基因芯片 利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究 背景资料　　基因芯片（Gene Chip）就是利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条ＤＮＡ探针。由于芯片上有序地排列着ＤＮＡ探针，因此也被称为微阵列(Microarray）。在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息