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基因工程 转基因生物 一、基因工程概述 二、基因工程的主要工作 三、基因工程中常用的技术 四、基因工程技术在医学领域中的应用基因工程（genetic engineering） 一、基因工程概述 概念： 定向改造细胞或生物个体的特性 所用的方法及相关的工作。 1、可在亲缘关系极远的生物之间 进行，能大幅度地改变生物遗 传特性 2、能定向地改变生物遗传特性 3、能快速和稳定地获得新品种 基因工程的优越性 二、基因工程的主要工作（一）工具酶（二）载体（三）主要工作 （一）工具酶 限制酶 修饰酶 类型 1、限制酶 （restriction enzyme） 全称： 限制性内切核酸酶 识别双链 DNA 内部特异部位 裂解磷酸二酯键 来源： 原核生物细胞中分离 功能： 限制酶特点： ① 具有识别专一性和特异性（4—6个 bp ） 如：EcoRⅠ 5′-- G A A T T C -- 3′ BamHⅠ 5′-- G G A T C C -- 3′ HindⅢ 5′-- A A G C T T -- 3′ ② 具有特定的酶切位点 交错切割 平整切割 ④ 只识别核苷酸序列，不管 DNA 的来源③ 切割方式平整切割 — 切口平齐如 SmaⅠ5′CCCGGG 3′3′GGGCCC 5′交错切割 — 切口错位如EcoRⅠ5′GAATTC 3′3′CTTAAG 5′5′G AATTC 3′3′CTTAA G 5′ 2、修饰酶 DNA聚合酶Taq DNA 聚合酶 逆转录酶 耐热 DNA 聚合酶 T4 DNA 连接酶RNA 聚合酶 碱性磷酸酶 核酸酶 ① DNA聚合酶 方向：5′ 3′合成 DNA 链 ② 逆转录酶 以 RNA 为模板，合成 DNA ③ T4 DNA 连接酶 催化 DNA 链间的连接 （二）载体 载体------能运载目的基因进入宿主细胞并 进行增殖的 DNA 称为载体。 1、质粒（plasmid） 独立于细菌染色体以外的一种遗传物质。 为环状闭合双链DNA（通常可接受 10 Kb 以下的外源基因）； 能独立地进行复制； 中，随细菌染色体一同复制 常用的载体能自由地进入细菌；可以整合到细菌染色体 2、噬菌体（bacteriophage ， phage ） 细菌病毒，为环状双链DNA（通常 可接受 20 Kb 以上的外源基因） 作为载体应满足的条件 1、分子量相对较小，能在细菌体内稳定 存在，有较高的拷贝数 2、具有多个限制酶的单一酶切位点 3、具有一个以上的便于选择的遗传标志 4、载体上插入外源 DNA 后，不影响其自 身的复制能力且对宿主细胞无毒害 5、最好含有启动子，控制并促进外源 DNA表达 （三）主要工作 1、获得特定的基因片断 2、基因片断与运载体结合 3、将重组DNA分子引入宿主细胞 4、扩增 5、筛选 6、检测 三、基因工程中常用的技术 （一）核酸分子杂交技术 （二）核酸分子的体外扩增 核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条 件下按碱基配对原则形成双链的过程。 杂交的双方分别称为探针（probe）与待测核酸 AＴＴＣＧＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＡ（一）核酸分子杂交技术待测核酸探　　针　１、核酸分子杂交的基本原理　①　基本原理：　碱基互补原则　②　DNA 的变性与复性　变性　　导致 DNA 两条链之间的氢键　断裂，而核酸分子中的所有共　价键不受影响，称为DNA变性。　复性　　去除DNA变性因素，两条DNA链　重新结合成DNA双螺旋结构，称　为DNA复性。　　２、核酸分子杂交的基本方法　类型待测核酸片段　探针Southern blot　DNA　DNANorthern blot　RNA　DNADot blot DNA RNA　DNA或 RNA　In situ hybridizationDNA RNA　DNA或RNA 　　 Southern 印迹杂交 （Southern blot）　 　检测细胞中的 外源 DNA 分子 １、待测核酸样品的制备　２、待测 DNA 样品的电泳分离　３、凝胶中核酸的变性　４、转膜　５、探针制备　６、杂交　７、洗膜 8、 杂交结果的检测目的：步骤：含有EB染料的琼脂糖凝胶酶切基因组DNA基因组DNA标准分子量DNA高盐缓冲液重 物玻璃板变性吸引滤纸凝胶硝酸纤维素膜转膜与探针杂交的基因DNA片段X底片制备探针杂交Southern 杂交法 （二）核酸的体外扩增 （polymerase chain reaction , PCR）