氯化钙法制备感受态.docVIP

我制氯化钙法感受态的步骤：1) 取大肠杆菌单菌落接种于2 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200 rpm过夜培养；2) 取0.5 ml菌液接种于50 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200 rpm培养2.5 h （OD600nm介于0.4-0.5）；3) 菌液倒入冰浴预冷的50 ml离心管中，冰浴20 min，随后利用台式冷冻离心机在4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置1 min；4) 50 ml离心管中加入30 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，冰浴30 min，4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置片刻；5) 离心管中加入2 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，以滴管分装，滴加2滴（约100 μl）于每个1.5 ml EP管中，冰浴放置，以备马上使用，余下加入甘油，使甘油终浓度约15%，同上分装于1.5 ml EP管中，-20 ℃冻存（-80冰箱存更好，但咱舍不得总去开它），冻存感受态可在一周内使用（转化效率将随保存时间延长而有所下降）。需要注意的是：氯化钙经常是水合物，你得看清楚你用的氯化钙水合物的分子量，然后再换算。氯化钙溶液是过滤除菌的，使用液用前需要预冷。另外，要是总弄不好也可以买商业化的感受