流式细胞仪原理及操作步骤.docVIP

流式细胞仪原理及操作步骤 流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。　　(一)　原理　　活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。　　(二)　操作步骤　　　　　制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、　　　　　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)　　　　　　　　的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS　　　　　　　　稀释)