一步法提取总RNA.docVIP

异硫氰酸胍一步法提取总RNA 【试剂配制】 1、变性液D：4M异硫氰酸胍（Quanidine thiocyanate），25 mM柠檬酸钠（Sodium Citrate），0.5% N-月桂酰肌氨钠（Sarkosyl），0.1 M β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）； 2、2M 醋酸钠（NaAc），pH4.0； 3、水饱和酚（Phenol, H2O saturated， pH4.0）； 4、49:1 氯仿/异戊醇（Chloroform/Isoamyl alcohol）； 5、100%异丙醇（Isoproponal）； 6、75%乙醇（Ethanol），用DEPC处理水配制； 7、DEPC处理水（DEPC-treated H2O）； 以上试剂均4℃ 【操作方法】 1、收集培养细胞置1.5mL Ep管中，至细胞量达到106～107，弃掉培养基，加入500μL变性液D，充分震荡，混匀，使细胞充分裂解；若是组织，取组织约100mg，加入500μL变性液D，在匀浆器中研磨匀浆，转移至1.5mL Ep管； 2、加入50μL 2M醋酸钠（pH4.0），颠倒混匀； 3、加入500μL 水饱和酚和100μL 49:1的氯仿/异戊醇，充分混匀，置于冰浴10min；（可见有乳白色的乳浊液形成，至于冰上一会可见有不清晰的分层，若是澄清液体，则再加入50μL 49:1的氯仿/异戊醇，充分混匀） 4、14,000g，4℃，离心10min，小心将上层水相转移到新的1.5mL Ep管中；（样品分为三层，上层含RNA的水相，下层含DNA的酚相，中间变性的白色蛋白质，取200μL枪调到150μL，大约能取3次，约共450μ 5、加入等体积100%异丙醇，置于-20℃ 6、14,000g，4℃，离心15min，弃掉液体，在吸水纸上倒扣吸净残余液体； 7、加入700μL 75%乙醇，颠倒Ep管，洗RNA沉淀，14,000g，4℃，离心5min，弃掉液体，再用75%乙醇洗一遍；（RNA沉淀在75%乙醇中不会溶解，颠倒两下即可；可以将RNA在75%乙醇中储存于-80 8、将Ep管置于室温（或50～60℃加热干燥），使管内的乙醇充分挥发掉，加入适量（约30μL）DEPC处理水溶解RNA，10μL分装，-80 【注意事项】 操作过程要尽可能降低RNase污染，保持环境清洁，佩戴一次性口罩、手套，所用Ep管、枪头均经过1‰DEPC水溶液过夜浸泡，高压灭活，烘干后使用。 （为减少DEPC对身体的伤害，Ep管、枪头高压消毒2～3次即可使用，避免冲管口说话，前面几步要快，特别是组织匀浆时，要快）