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实验一 DNA 重组与细胞转化 实验时间：2015.09.10 姓名：朱恂 学号：09301016020 专业：临床八年 带教老师： 实验目的： 用粘端连接法将原癌基因 c-myc 外源 DNA 片段连接到 pSV2 质体载体中重建组织质粒 用 CaCl2 法制备感受态细胞（E.coli HB101） 将含有目的基因的 pSV2 质粒转入感受态细胞 用含抗菌素的平板培养基筛选转化体 实验原理： 质粒载体（pSV）的构建 目的基因（c-myc 基因片段）的获取 载体与目的基因的连接（粘端连接） 重组体导入受体细胞（CaCl2 法制备感受态细胞） 鉴定重组体 目的基因在细胞中的表达 表达产物的分离、鉴定 实验器材与试剂： 1.器材 恒温摇床、电热恒温培养箱、无菌操作超净台、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、 漩涡振荡器、移液器、1.5ml 离心管、制冰机、接种环、三角推棒、滴管等 2.试剂 用 BamH I 和 Xba I 处理的线状 pSV 质粒 DNA（20ng/μL） 用 BamH I 和 Xba I 处理的 4.8kb c-mycDNA 片段（20ng/μL） 已连接好的 c-myc 目的片段的 pSV 重组质粒 DNA（5ng/μL） T4 DNA（5ng/μL）连接酶及 10x 连接缓冲液 LB 培养基 含琼脂的 LB 培养基 0.1mol/mlCaCl2 溶液 氨苄青霉素储存液（100mg/mL） 实验步骤： 1.粘端连接： 1）1.5ml 离心管中加入： 目的基因片段（4.8kb）（20ng/ μL） 载体 DNA（3.5kb）（20ng/ μL） 4μL 2μL 10x 连接 buffer 1μL T4 DNA 连接酶 0.5μL ddH2O 2.5μL 2）混匀，16℃水浴中温浴 2-4 小时 2.CaCl2 法制备感受态细胞： 1）取 0.1ml 大肠杆菌 HB101 培养物，加至 5mLLB 培养液中，37℃振摇 2h，细菌长成云雾 状 倒入冰预冷的 15ml 离心管，冰浴 10min 4℃，4000rpm，离心 10min 弃上清，在纸巾上倒置 1min 沉淀重悬于冰预冷的 1ml,0.1ml/L CaCl2，混匀 转入 1.5ml 离心管，冰浴 10min 4℃，4000rpm，离心 10min 弃上清，在纸巾上倒置 1min，重悬于 200μL0.1ml/L CaCl2，分装成 50μL/管 3.重组质粒转化感受态细胞： 1）5μL 连接产物或 1μL 阳性对照分别加入 50μL 感受态细胞，冰浴 30min 2）42℃ 90s 立即冰浴 1-2min 分别加入 LB 培养液 150μL，37℃振摇 45min 分别取 100μL 实验组和 100μL 对照组铺板于含 Amp 的 LB 平板 37℃温箱培养过夜 实验结果： 阳性对照组具有抗氨苄培养基特性，故在培养基上能顺利生长；实验组经过转化的 E.coli HB101 含外源性质粒 pSV2，含抗氨苄青霉素基因，故在含氨苄青霉素的平板上能顺利生 长，生出了较多的单菌落，其数量尚可。 注意事项： 粘端连接加样前要短暂离心，要注意加样顺序，加样完成后要先混匀再离心 CaCl2 法制备感受态细胞时在火焰旁 5cm 无菌圈操作 离心时要注意平衡 连接后的 DNA 溶液与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如温度过高，转化 效率差 42℃热处理很关键，转移速度要快，温度要准确 菌液涂皿时动作要轻柔，避免反复来回，过多的挤压会使细胞破裂，影响转化率 加样时注意先加体积大的，再加体积小的 实验讨论： 1.为了提高转化率，可考虑： 细胞生长状态与密度：不要用经过多次继代的培养菌，细胞生长密度以刚进入对数生长 时期为好，密度过高或不足均会影响转化率。 质粒的质量与浓度：转化率与外源 DNA 浓度一定程度上成正比，但外源 DNA 的量过 多或体积过大，转化率反而会下降，需控制在一个恰当的比例。 试剂的质量：所用试剂如 CaCl2 均需是高纯度的，最好分装于干燥的冷暗处。 防止杂菌和杂 DNA 的污染：实验过程注意无菌操作，所有试剂应当灭菌，注意防止被 污染，以免影响以后的筛选、鉴定。 2.若经过转化的受体细胞在氨苄青霉素培养基中未生长，可能是什么原因？ 细菌在种入培养基前已死亡：接种时推板力度过大、次数过多可能导致细胞活性降低或 死亡，在生长基上细菌数量过少，密度过低，难以形成菌落。 抗性基因未转入细菌：细胞感受态制备不成功，可能因为试剂被污染、离心后震荡过于 剧烈、大肠杆菌 OD 值控制不当、反复冻融使细胞裂解或质粒转入感受态细胞前受到环境 污染等原因所致。 3.作感受态时为何要在冰浴下进行？ 冰浴可降低细胞膜的流动性，利于 DNA 结合，同时使细胞