细胞总蛋白提取.doc

细胞总蛋白提取 准备： 1、冰盒、提前开启低温高速离心机、预冷1× PBS、细胞刮刀、移液器（吸头）。 2、1×RIPA buffer [Thermo (89901)]、100×Cocktail [CALBIOCHEM (#539131)]、100×PMSF [Beyotime (ST506-2)]、10×Phosstop [Roche (4906837001)] (Cocktail 和Phosstop 分装储存于-20℃，需提前置于冰上解冻，根据xuyao)。Cocktail和Phosstop的配制方法为：1粒药片加入1ml RIPA buffer [Thermo (89901)]，分别配成100X Cocktail 和10X Phosstop。 PMSF:丝氨酸蛋白酶抑制剂, -20℃保存1年。 Coaktail:抑制丝氨酸、半胱氨酸、金属蛋白酶；2- 8°C保存1-2周，-20°C可保存至少1个月。 PhosSTOP可同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸酶，及丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶在内的多种磷酸酶。溶解后的储存液体4℃可以稳定保存一个月以上，-20℃下可以保存6个月。 【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。 3、标记并预冷1.5ml离心管（样品数）、0.5ml离心管（样品数）、0.2ml离心管（样品数）。 样品： 1、根据实验需求干预细胞，蛋白提取前用显微镜拍照记录细胞数量及状态（用于评估需要裂解液的量和Western Blot数据分析参考）。 举例：HCT-8细胞接种于2块6孔板中，用PZH干预24h后，对照组细胞汇合度约为80%时，PZH 0mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml所需加入裂解液的体积为60μl、60μl、60μl、50μl，即所需加入孔中裂解液总量为690μl，所配量比所需份数多2-3份，预计所配量为800μl（1× RIPA Buffer 704μl + 100× Cocktail 8μl + 100× PMSF 8μl + 10×Phosstop 80μl、），剩余裂解液另存于离心管中保存于-20度，供测定BCA时使用。提取在冰上操作及试剂置于冰上保存。 6 well plate 裂解液60μl PZH 0mg/ml 裂解液60μl PZH 0mg/ml 裂解液60μl PZH 0mg/ml 裂解液60μl PZH 0.25mg/ml 裂解液60μl PZH 0.25mg/ml 裂解液60μl PZH 0.25mg/ml 6 well plate 裂解液60μl PZH 0.5mg/ml 裂解液60μl PZH 0.5mg/ml 裂解液60μl PZH 0.5mg/ml 裂解液50μl PZH 0.75mg/ml 裂解液50μl PZH 0.75mg/ml 裂解液50μl PZH 0.75mg/ml 2、移去培养液，用1ml预冷的1× PBS洗细胞，移去PBS，倾斜置于冰上。（例：6孔板PBS量：0.5ml） 3、按上述需要配好裂解液，把裂解液加到孔中(宁少勿多)，立即用细胞刮刀（6孔板可用200ul tips刮，不同孔换tips）把细胞刮到一角，把液体收集到1.5ml离心管中，置于冰上。 4、每隔5min涡旋震荡一次，使细胞完全裂解。 5、15min后，4℃、14000rmp离心20分钟。 6、把上清液转移到新的0.5ml离心管中，置冰上。用0.2ml离心管分装3μl蛋白供BCA测定时使用。所有蛋白置于-80℃保存。 注意事项： 1、低温可避免蛋白降解，所有离心管需预冷。 2、PBS要吸干，但避免细胞干掉，以免使蛋白浓度过低。 3、整个蛋白提取过程要快，这能保证干预的效果。 4、若时间允许，可以立刻进行BCA定量，可省一套0.2ml离心管。蛋白要避免反复冻融，提取后立刻测定BCA的蛋白可以根据所测定浓度以每管75μg分装（即每次所需量50μg的1.5倍，注意加入的5×loading也为1.5倍）；未测定BCA前可以分装成2份，置于-80℃保存。根据实际情况而定，建议药物干预时间合理安排，在上午或中午进行蛋白提取，下午则可接着进行BCA定量；但需要提取不同时间点蛋白时，则可将所有时间点蛋白提取好之后再同一次进行BCA定量实验。