浙江大学生物化学实验甲甲质粒DNA小批量提取与酶切鉴定.pptVIP

质粒DNA的提取与酶切鉴定 （一）质粒DNA的提取与电泳鉴定 1、质粒简介 质粒是一种寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA分子，大小为1kb~200kb之间，具有自主复制和转录的能力，但其复制和转录要利用宿主细胞（细菌）编码的一些酶和蛋白质。 2、分离纯化质粒的原理 分离纯化质粒DNA主要是利用宿主细菌DNA与质粒DNA之间的差异来进行的。 （一）质粒DNA的提取与电泳鉴定 细菌DNA与质粒DNA形状上均为双链环形，但二者的分子量相差较大，细菌DNA的分子量在109D左右，而质粒DNA的分子量仅为106 ~107D， 提取纯化质粒的过程中，细菌DNA大多断裂成线状分子，而质粒DNA则多数仍为双链环状，从而即可将二者分开。 本试验采用微量碱变性法来分离纯化质粒DNA，具体的分离纯化原理如下： 0 细菌 （含质粒） 溶菌酶 （震荡） 破细胞壁 SDS NaOH （细菌DNA和质粒DNA均通过碱变性成为线状分子） 破细胞膜 冰醋酸 细菌DNA与变性蛋白和细胞碎片缠 绕在一起（不能复性） 质粒DNA经复性后变为共价闭合环状 离心 沉淀：细菌DNA、细胞碎片等 上清：质粒DNA、RNA、可溶性蛋白等 酚：氯仿 离心 下层：酚，氯仿 中层：变性蛋白 上清（水层）：质粒DNA、RNA等 无水乙醇 离心 上清：可溶性杂质等