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L/O/G/O 报告基因分析 1. 基本概念和实验原理 报告基因: 编码可供检测的酶与蛋白质的基因。是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具。 可作为报告基因的条件: ① 编码产物的活性不受宿主细胞的干预。 ②编码产物在宿主细胞中不存在, 易于区别。 ③编码产物的活性的测定必须具有快速、简便、 灵敏度高、重复性好的特点。 常用的报告基因：氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)、 β-gal、荧光酶基因(Luc) 2. 用途： 基因转录调节的研究：最初的功能。 作为分子标记的应用：如利用 GFP 作为标记物检测基因在植物 酵母和哺乳动物细胞中的转移。 生物大分子之间的相互作用：激活剂或拮抗剂在改变活细胞中受体活性作用等方面的研究。 其他方面的应用：RNA 干扰研究、影像技术及药物筛选等。 3. 实验技术： 基因克隆 转染细胞 产物检测 基因克隆的特点和技术路线 特点：分子水平上操作，细胞水平上表达 技术路线： 1 分离制备目的DNA片段和载体 2 目的DNA与载体的剪切 3 目的DNA与载体的连接 4 重组DNA分子转化宿主细胞 5 筛选阳性克隆，大量扩增 在这个过程中： 1.“基因剪刀” 剪切DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起 3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因如IL2好比乘客，车子把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗（IL2/LAK→抗癌）。 一、目的基因的获取 直接从染色体DNA中分离 通过mRNA反转录合成 cDNA 从基因组DNA文库获取目的基因 从cDNA文库获取目的基因 PCR扩增目的基因 人工体外合成基因片段 二、载体 定义：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。 特性： 1 复制起点 (ori) 2 多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点 3 筛选标志 Amp+ Kan+ Neo+ 4 分子量不宜过大 否则易断裂、转化效率低 5 表达载体还要有P、E、前导序列、加尾信号、信号肽、核定位序列等 载体的分类 分类依据 类 别 克隆扩增或表达 举 例 1.按功能分成 （1）克隆载体 （2）表达载体 √ √ PBR322 PCDN3 2.按进入受体细胞类型分 （1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体 PUC8 PBUDCE41 YE 3.按载体来源分 质粒载体 噬菌体载体 病毒载体 pGEX-4T M13 pAdV5 4.按克隆片段得大小（克隆能力）分 (1)1kb (2)10kb (3)22kb (4)50kb (5)0.1-0.4Mb (6)0.5-2Mb (1)M13 (2)plasmid (3)λphage (4)casmid (5)BAC (6)YAC √ 常用的报告基因载体类型： 1）basic 载体：不含 P/E,用于检测启动子活性。 2）control载体：含启动子，用于检测增强子或沉默子的活性。 酶切注意事项（最好双酶切） 酶的保存：低温保存，冰上操作。贮存环境是甘油，避免反复冻融。 酶切反应体系：酶量不能超过反应体积的1/10。 反应缓冲液：合适的pH值、盐离子浓度，配套提供。 DNA样品要求：一定纯度和浓度，不能混有酚、氯仿、 EDTA、 SDS、 过多盐类等。 温度和时间：通常37℃ 1-2h 反应终止：EDTA 、SDS 、加热 、直接放入 -20℃ 操作要求：无菌新的dorf管、枪头、去离子三蒸水。 电泳鉴定酶切是否完全 。 连接-定向克隆（最常用） 方法：双酶切 优点：防止载体自身环化 正向插入 单拷贝插入 连接效率高 L/O/G/O