免疫组化操作步骤(自编).docxVIP

免疫组化操作步骤 一 免疫组化（ LP 法）操作步骤 ： 1． 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行 缓冲液洗 3min/2 次。 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。 缓冲液洗 5min/2 次。 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。 （注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。） 缓冲液洗 5min/2 次。 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决 定） 缓冲液洗 5min/2 次。 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。 ．缓冲液洗 5min/2 次。 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。 （注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。） 12 ．缓冲液洗 5min/2 次。 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。） ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。 二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤 ： 石蜡切片脱蜡至水。 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 （ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。 （ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清， 勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ） 自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。 三. 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片 4-8um ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟 x3，用过氧化氢孵育 5-10 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。以下同石蜡切片免疫 组化 三、免疫组化方法中关键环节及其原理解述 （一）酶免疫组化的 环 本固定：固定的目的是①防止 本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗 结合的类 脂，使抗原抗 结合物易 获得良好的染色结果；③固定的 本易 保存。 脱水、石蜡包埋和 片：脱水用梯度乙醇（由低到 ）充分脱水、对组织 完全浸蜡、 切片时刀片 干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。 脱蜡和水化：这是为了后面的抗 等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡 可以先 60 度 20min，然后立即二甲苯 1-3 分别 10min，但当天 好的切片可以 60 度 3- 4h。水化用梯度乙醇（由 到低）。若脱蜡和水化不全易出 局灶性反应和浸洗不全， 而产生非特异性背景着色。 抗原修复：由 组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过 中，发生了蛋白之间交联 及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露， 提 抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种， 压修复、微波修复、胰酶 修复。修复液也分为若干种（具 的可以查阅相 资料，大量的：中性的、 pH 的等）。 我们实验室一般用微波修复中火 6min*4 次，效果不错。注意微波修复后自然冷却 30min 左右（只 你觉得修复液的温度达室温即可）。 5、细胞通透：目的是使抗 能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用 Triton X- 100、蛋白酶 k 等通透液。如 Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的 脂质而使抗 及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使 用，这样抗 就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（10um 厚切片） 和 免疫细胞化学中一般用 Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。 灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的 ABC 法和 SP 法中，免疫组化反应结果容 易收到内源性过