免疫荧光染色步骤.docxVIP

免疫组织化学染色步骤 ．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒 精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精 2min→80%酒精 1min→70%酒精 1min）， 蒸馏水冲洗后，0.01M PBS 冲洗，5min×3 次； ．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达 92-96℃，维持 10-15min，自 然冷却至室温，0.01M PBS 冲洗，5min×3 次； 3．3%H  2 O  2 溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3 次； ．正常羊血清封闭，37℃，30 min； ．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2 小时或者 4℃过夜，0.01M PBS 冲洗， 5min×3 次； ．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS 冲洗，5min×3 次； ．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS 冲洗，5min×3 次； ．DAB 避光显色，显微镜下控制显色时间； ．0.01M PBS 终止显色； ．梯度酒精脱水（70%酒精 1min→80%酒精 1min→95%酒精Ⅰ1min→ 95%酒精 Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min→ 二甲苯Ⅱ10min； 11．中性树胶封片。 免疫荧光染色步骤 将组织切片脱蜡入水； 抗原微波修复，温度 92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温； 正常羊血清封闭，37℃，60 min； 倾去多余血清，滴加一抗，37℃2 小时或者 4℃过夜，PBS 冲洗，5min×3 次； 滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS 冲洗，5min×3 次； 防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。 荧光显微镜观察拍照。 细胞免疫组化染色（培养板中染色） ．培养的细胞，弃去培养基，冷的 PBS 洗两次，首先用 4%多聚甲醛（4 孔板 200μl）固定 10min，PBS 洗 2 次，每次 5－10 分钟。 ．在含 0.1% Triton X-100（4 孔板 200μl）的 PBS 中进行 10min 的透膜处理， PBS 洗 2 次，每次 5-10 分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。 ．羊血清用 PBS 配制成 4％羊血清封闭液，室温封闭（4 孔板 200μl）30 分钟。 ．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于 37℃条件下孵育 1h 或放在 4℃冰箱过夜， PBS 洗 3 次，每次 5-10 分钟。 ．去除一抗后，细胞用 PBS 洗三次。 ．加入二抗，然后加入相对应的孔，在 37℃下作用 30-60min。PBS 洗 3 次， 每次 5-10 分钟。 ．吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用 30-60min。PBS 洗 3 次，每次 5- 10 分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。 8．DAB 避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．PBS 终止显色；显微镜下观察拍照。 细胞免疫荧光染色（培养板中染色） ．培养的细胞，弃去培养基，冷的 PBS 洗两次，首先用 4%多聚甲醛（4 孔板 200μl）固定 10min，PBS 洗 2 次，每次 5－10 分钟。 ．在含 0.1% Triton X-100（4 孔板 200μl）的 PBS 中进行 10min 的透膜处理， PBS 洗 2 次，每次 5-10 分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。 ．羊血清用 PBS 配制成 4％羊血清封闭液，室温封闭（4 孔板 200μl）30 分钟。 ．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于 37℃条件下孵育 1h 或放在 4℃冰箱过夜， PBS 洗 3 次，每次 5-10 分钟。 细 细胞爬片后的步骤同切片的免疫组织化学及免疫荧光的步骤。 ．去除一抗后，细胞用 PBS 洗三次。 ．滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS 冲洗，5min×3 次； ．防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。 ．荧光显微镜观察拍照。 HE 染色 1. 石蜡切片常规脱蜡入水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各 15min→100%酒精Ⅰ、Ⅱ→95%酒 精Ⅰ、Ⅱ→80%酒精→70%酒精→50%酒精各 1-2min。 2．水洗：普通水洗 2 次，蒸馏水洗 1 次。 苏木素染色 10min。 充分水洗：自来水洗 10min。 盐酸酒精分色：分色 10-30s，随时镜检分色程度，使不该着色的部分全部褪 去，应着色的部分着色适当。着色标准：胞核为深蓝色，胞质无色或浅灰色。 6. 充分水洗：自来水洗 10min。 氨水蓝化 2-3min。 充分水洗：自来水洗 10-15min，水洗后若染色太浅则可重新返回苏木素。 脱水：70%、8