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激光捕获显微切割 Laser capture microdissection (LCM) technology 是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织 形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细 胞 ，通常用于从 组 织中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的 细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或 免 疫 细 胞相互粘附。在正常 或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺 激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的 分子变化。在 病 理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子 改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然 而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分； 同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发 生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就 显得非常必要。1996 年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所 的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国 Arcturus Engineering 公 司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技 术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至 单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已 成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术  [1]  。 原理：LCM 的基本原理是通过一低能 红 外 激 光脉冲激活热塑膜—— —乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸 [2][3] [2] [3] 收峰接近红外激光波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎 片粘到该膜上 。LCM 系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、 激光控制装置、控制显微镜载物台（固定载玻片）的操纵杆、电耦 合相机及彩色显示器。用于捕获目标细胞的热塑膜直径通常为 6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰与后继实验所用的标准 0.5ml 离心管相匹配。 机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的 目标部位。显微镜直视下选择目标细胞，发射激光脉冲，瞬间升温 使 EVA 膜局部熔化。熔化的 EVA 膜渗透到切片上极微小的组织间隙 中，并在几毫秒内迅速凝固。组织与膜的粘合力超过了其与载玻片 间的粘合力，从而可以选择性地转移目标细胞。 激 光 脉 冲通常持续 0.5~5.0 毫秒，并且可在整个塑料帽表面进行多次重复，从而可以 迅速分离大量的目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上， 将所选择的细胞转移至离心管中，从而可以分离出感兴趣的分子进 行实验 。 EVA 膜约 100~200μm 厚，能够吸收激光产生的绝大部分能量， 在瞬间将激光束照射区域的温度提高到 90°C，保持数毫秒后又迅 速冷却，保证了生物大分子不受损害。采用低能量红外激光的同时 也可避免损伤性光化学反应的发生。 优缺点：LCM 最显著的优点在于其迅速、准确和多用途的特性。结 合组织结构特点以及所需的切割精确度，通过选择 激 光 束的直径大 小，可以迅速获取大量的目标细胞。LCM 与以显微操作仪为基础的 [4][5][6][8][9] [4] [5] [6] [8] [9] 显微切割技术相比 ，具有以下优点：(1)分离细胞速度快，无需精 巧的操作技能；(2)捕获细胞和剩余组织的形态学特征均保持完好， 可以较好地控制捕获细胞的特异性；(3)捕获细胞与塑料帽结合紧密， 减少了组织损失的风险。相比而言，除了激光切割弹射微分离系统 以 经染色的用于存档的切片也可被成功进行显微切割。 尽管 LCM 应用广泛，但对于常规染色、固定且不加盖玻片的组 织切片，其视觉分辨率受到很大限制。而对于那些本身缺乏一定结 构特点的复杂组织（如 淋 巴 组 织，广泛浸润的腺癌等），要准确分 离出某一类细胞几乎是不可能的。Fend 等 通过采用特殊染色，尤 其是免疫组化方法，使目标细胞或想要去除的细胞变得更加醒目， 从而解决了上述难题。 应用 LCM，偶尔会出现无法将选择的细胞从切片上移走的情况， 出现这种结果有两种原因：(1)细胞与热塑膜之间的粘合力不足，通 常是由于组织未完全脱水或激光的能量设置过低造成的；(2)组织切 片与 载 玻 片间的粘合力过强，通常发生在显微切割干燥时间过长的 冰冻切片。针对不同样本组织（包括免疫组化染色的组织切片）， 一些研究小组分别详尽报道了采用适合的处理方法，以达到最佳的 显微切割条件  [7]  。 应用：LCM 较以往的显微切割技术有了突破性的进展，现已广