转基因的方法.ppt

做实验，找威斯腾 威斯腾生物技术中心 转基因的方法 转基因的方法和原理 1目的基因制备和载体系统 2几种有效的转基因方法 3定点突变和受体系统 简介 转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。 转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。 转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。 基本步骤 1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到能自我复制又带有选择标记的载体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞； 4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆； 分离基因 克隆到某中间载体 转化大肠杆菌 提取质粒 限制酶切/连接 克隆到植物表达载体 转化农杆菌 基因枪转化 pKS,pBR332,pGEM-T JM109, TOP10… HindIII/EcroI… T4 ligase pBI121, pCAM1001… LBA4404, EHA 目的基因制备和载体系统 目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。 载体：质粒、λ噬菌体 、柯氏质粒 、YAC载体 等 工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶 等 PCR反应 PCR技术就是在体外通过酶促反应或自发地扩增一段目的基因的技术。 PCR要求反应体系具有以下条件： 1、要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物(约20个碱基左右)； 2、具有热稳定性的酶如Taq DNA聚合酶； 3、4种dNTP； 4、作为模板的目的DNA序列。 PCR反应可扩增出100～5000bp的目的基因。 PCR反应过程 1、变性，即将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA； 2、退火，将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物分别与变性后的两条模板链相配对； 3、延伸，将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。 反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。 利用cDNA法 由于真核生物的mRNA具有poly A这一结构特点，可以用结合长度大约为15bp的短链多聚DT的纤维素填充的柱子，根据碱基配对原则，将其吸附，从真核细胞的总RNA中提取出来，再用能打断A-T氢键的缓冲液洗脱。 在mRNA群体中，有高丰度的mRNA，拷贝数多；也有低丰度的mRNA，但种类多，高丰度的mRNA容易合成cDNA。 要保证构建的cDNA文库中要含有目的克隆，可利用琼脂糖凝胶电泳、非变性蔗糖梯度离心和羟甲基蔗糖剃度离心等分级分离不同长度的mRNA，也可以利用cDNA的大小分级分离。 cDNA链的合成 得到纯化的mRNA后，再利用逆转录酶和DNA聚合酶I，缓冲液和4种脱氧核糖核苷三磷酸及短的digo（dT）分子作为引物，合成cDNA。 这些cDNA是由该种生物的各种mRNA分子逆转录得到的，因此是混合物，它们可以通过末端连接或是加入衔接物等其它方法克隆进入质粒载体，形成cDNA文库。 然后，采用DNA杂交或免疫分析的方法来筛选目的基因 质粒载体 质粒（plasmid）是能自我复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在。 每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它能帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。 高拷贝数的质粒，在宿主细胞中能达10～100个拷贝；低拷贝数的质粒，在宿主细胞中只有1－4个拷贝。 质粒要成为克隆载体，就必须进行遗传改造，使之成为一个具有单一的限制性内切酶识别位点、多个选择性标记。 质粒载体pBR322 1.大小为4361bp，含有抗氨苄青霉素和抗四环素这样两个抗生素抗性基因 2.在四环素抗性基因内部，还具有BamH I、Hind Ⅲ和Sal I 三个识别位点。 3.Pst I识别位点在氨苄青霉素抗性基 4.pBR322带有一个复制起点，可以保证质粒只在大肠杆菌里进行复制功能。 pUC19质粒 长2686bp，带有pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子β－半乳糖苷酶基因（lac Z’）的调节片段，一个调节lac Z’基因表达的阻碍蛋白的基因lac I，还有多个单克隆位点。 pUC19的筛选将转化细胞涂布到含有氨苄青霉素、IPTG和X－gal的固体培养基上，那些带有自身环化质粒的细胞由于能够形成具活性的β－半乳糖苷酶，所以菌落是蓝色，如果插入有目的DNA片段，无法形成杂合β－半乳糖苷酶，菌落时白色的。 几种有效的转基因方法