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慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒， 三种质粒载体分别进行高纯度无内毒 素抽提，共转染 293T 细胞，转染后 6 h 更换为完全培养基，培养 48 和 72h 后，分别收集 富含慢病毒颗粒的细胞上清液， 病毒上清液通过超离心浓缩病毒。 以下内容由 汉恒生物科技 （上海）有限公司 精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为 TM pspax2, pMD2G, pHBLV 系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株 293T ，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株 大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞 293T 细胞的培养 （一） 293T 细胞的冻存 随着传代的次数增加， 293T 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的 出现， 我们需要在开始就对细胞进行大量冻存， 以保证实验的稳定性和持续性。 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入 PBS洗去残留的培养基； 2、加入 0.25%的胰酶，消化 1～ 2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10 ％ DMEM，用 10mL 移液管 进行吹打，较大力吹打 6 ～ 8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于 15mL 离心 管中， 取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计 数时， 4 大格均计 数，总数除以 4 （得每大格细胞数） ，再乘以 10 （ 10 倍稀释），即 为实际 n 万 /mL 细胞浓度。 -36- 4、细胞离心， 1000rpm，5min 。去掉上清。 5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（ 70%完全培养基 +20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞， 密度为 3 x 10 6 个 /ml 。 6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入 -80 ℃超低温冰箱。 7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。 （二） 293T 细胞的传代 当细胞生长到汇合率达到 80%～ 90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 1、消化细胞，方法同细胞冻存。 2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。 3、根据具体情况，将细胞分到 10cm培养皿中，每个培养皿补足到 10ml 培养基。 4、将培养皿平稳放回 37℃、 5%CO2和 95%相对湿度的培养箱中培养。 （三） 293T 细胞的复苏 当细胞传代次数过多， 细胞状态变差时， 或者细胞出现污染事故时， 需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。 1、设置温度为 37～ 42℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻 伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在 1～2min 内使细胞溶液完全溶解。 3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中， 并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养基， 混匀后离心， 1000rpm， 5min。 4、去掉上清，加入 5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm 培养皿。 5、将培养皿平稳放入 37℃、 5%CO2和 95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。 四、慢病毒包装和浓缩 -37- （一）质粒扩增 构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1ug/ul,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。 （二）传 293T 细胞 将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min ，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪用 10mL移液管进行吹打，较大力吹 打 6-8 次即可， 不留死角， 瓶口处较难吹打可将移液管对准培口， 小力将培养基打出即可覆 盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于 15mL离心管中， 取 50ul 混匀后的细胞