CHO细胞表达系统常见问题及解析.pdf

1 、问：请问有人养过 CHO 细胞吗？文献报道说用 DMEM 培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低 糖？ 参考见解： CHO 细胞用高糖 DMEM 养就可以了 ，比较好养， 10% 血清 ，小牛和胎牛都可以， 长得比较慢， 跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板 上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。 2 、问：要转染钾通道 pcDNA3.1 入细胞， 是选 cho 细胞呢还是 hek293 细胞？ cho 细胞转染效率高吗？ 参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出 问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验 之前，必须要先 确认蛋白的表达，通常的实验有 ： （1 ）采用 免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵 。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可 以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。 （2 ）WESTERN-BLOT 。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。 （3 ）构建一 个 N 或 C 端带荧光蛋白的质 粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用 GFP ）有可 能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。 当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个 DNA 测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！ 3 、问：由于我要用 CHO 细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长 参考见解： 培养 CHO 细胞最好用 F12 ，并且由于 F12 中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血 清很少的情况下应用 ，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。我们 的前辈曾用 F12 在无血清的条件下成功的克隆出 CHO 细胞。 无血清培养 CHO 细胞有两种方法 ：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养 CHO 细胞的无血清培养基 （好 像 HyClone 就有）；第二种方法实际上是有血清培养，只不过血清浓度很低罢了，可以近似的认为无血 清。在第二种方法里，又可以分出两条途径：你可以分步进行，也可以一步到位。分步法是， CHO 细胞先 在含 10 ％血清的常规培养基里培养， 再到含 5 ％血清的培养基里培养， 再到含 2.5 ％血清的培养基里培养， 依此类推，培养基里的血清不断下降，直到一个能让 CHO 细胞良好生长的最低血清浓度。一步到位法就 是省去中间的步骤，直接由起点的血清浓度到终点浓度。 4 、问：我要做稳定转染，表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插入 pcDNA3.1 ， 没有插入其他的基因或者 tag 。现准备转染 CHO 细胞。就相关问题想问问： 有的文献上没有署名 K1 或是 DHFR, 普通所写的 CHO 细胞是指那种？野生型 CHO 细胞又是指的哪种？ 这三种细胞是不是因为 CHO-K1 和 CHO/DHFR- 有扩增基因 GS 和 DHFR, 可以更为有效的扩增进而表 达，比野生型 CHO 在转染中更起作用？ 如果就我的实验要求， CHO-K1 或者 CHO/DHFR- 更加适合，那么转染 CHO-K1 是不是可以直接转染？ 而转染 CHO-DHFR- 需要和携带 DHFR- 的标记质粒共转染？ 参考见解： 做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的， 这个载体同时可以过表达一个抗性基因， 如果载体整和到基因组上，这个抗性已经能够克服筛选压力，而这个时候你的目的蛋白也得到了有效的表 达。 （1 ）野生型 CHO 就是ＣＨＯ－Ｋ１ （2 ）CHO －DHFR- 是指ＤＨＦＲ缺陷型细胞，ＤＨＦＲ作为筛选标记