重组DNA分子的酶切、连接、转化和筛选.docxVIP

摘 重组 DNA 分子的酶切、连接、转化和筛选 要：本实验利用酶切后的目的片段（500bp）与 puc18 为材料， 运用氯化钙法制备感受态细胞和外源的重组体 DNA 转入受体菌细 胞，经过筛选培养基筛选后得到重组子。 关键词：酶切 重组 筛选 前 言 重组克隆是指含有外源 DNA 的细胞增殖而产生的细胞群体， 或由其经生长、发育和再生而形成的组织、器官、个体。重组克隆 的筛选主要依靠 DNA 载体上的选择标记，加上合适的选择（培养） 条件来进行。一是通过选择培养基使只有带外源 DNA 的细胞才能 生长；二是根据选择性遗传标记选择带有目的基因的细胞克隆。 1 材料与方法 1.1 材料 质粒 DNA、目的 DNA、E.coli 受菌体、质粒 pUC18、重组体 DNA 1.2 方法 1.2.1PCR 法扩增目的片段（CER3A） 1.2.1.1 PCR 反应体系 反应物  体积/ul PCR Taq mix 12.5 CER3Ar，CER3Af dd 水  各 1 9.5 质粒 CER3A 1 1.2.1.2 PCR 扩增条件  在 PCR 仪上设计 94℃5min，然后进入循环， 循环中第一步为 94℃30s，第二步为 58℃退火 30s，第三步为 72℃ 延伸 1min，共进行 35 次循环，然后再 72℃延伸 10min 以提高产物 的扩增率，取出放在 4℃条件下终止反应。 1.2.2 目的片段的电泳  将 10 倍 loading buffer 5ul 和 25ulPCR 产物混 匀，在 1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，分析。 1.2.3 目的片段的回收  通过琼脂糖电泳尽可能将目的 DNA 片段与 其他片段分开，用干净的手术刀，将含目的片段 DNA 的琼脂糖凝 胶块切下，放入 2ml 离心管称重。根据凝胶重量和浓度，按每 100mg 琼脂糖加 400ml 的比例加 bufferB2。将离心管置于 50℃水浴 5~10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。在酶切反应体系中加入 5 倍 bufferB2，混匀。将熔化好的溶液全都移到吸附柱，静止 2min，8000×g 离心 30s，倒掉收集管的液体，将吸附管放入同一收 集管中。向吸附管中加入加入 500ul Wash Solution，9000×g 离心 30s，倒掉收集管中的液体，将吸附管放在同一根收集管中。重复步 骤（6）一次。将空吸附柱和收集管放入离心机，12000×g 离心 2min，打开瓶盖，放置 2~5min，挥发酒精。换新的 1.5ml 离心管， 在吸附膜中加入 20ul dd 水（pH≥8.0），温室静置 5min，12000×g 离心 2min，将所得的 DNA 溶液置于-20℃保存或用于后续实验。 反应物 目的片段 SadⅠ  体积/ul 15 1.5 PstⅠ 1.5 10×loading buffer 10 dd 水  72 1.2.4 目的片段和 pUC18 质粒的酶切 1.2.4.1 目的片段的酶切 在 37℃反应 1~2h。 1.2.4.2 pUC18 质粒的酶切 反应物  体积/ul pUC18 15 SadⅠ PstⅠ  1.5 1.5 10×loading buffer 10 dd 水  72 在 37℃反应 1~2h。然后将吸取 2ul 酶切产物，加入 10×loading buffer 1ul 和 dd 水 7ul，在 1.2%琼脂糖凝胶上电泳，观察并分析结果。 1.2.5 DNA 片段与质粒 pUC18 的连接（体积的量不确定） 反应物 目的片段  体积/ul 5 pUC18 5 6×loading buffer 1 T4 ligase 2 1.2.6 重组体 DNA 遗传转化与克隆筛选 1.2.6.1 感受态细胞的制备  取对数生长期的大肠杆菌培养物 1ml 于 离心管中 7000r/min 离心 3~5min，倾去上清液后收集菌体置于冰浴 中。用 1ml 预冷的 0.05mol/L CaCl  2  悬浮菌体，于离心管中 7000r/min 离心 3~5min，倾去上清液后收集菌体置于冰浴中。再用 1ml 预冷的 0.05mol/L CaCl2 悬浮菌体，冰浴 15min，7000r/min 离心 3~5min，倾去上清液后收集菌体置于冰浴中。加入 100ul 预冷 0.05mol/L CaCl  2  悬浮后即为感受态细胞，可在 4℃下保存一周。 1.2.6.2 重组体 DNA 的遗传转化与克隆筛选  常温下熔化感受态细 胞，加入重组体 DNA40ng 左右，冰浴 30min。42℃热击 90s，冰浴 5min，加入 1mlLB 培养基，37℃温育 1h。区 230ul 菌体悬浮培养物 加入