DNA片段的琼脂糖凝胶电泳原理和操作步骤.docVIP

?DNA片段的琼脂糖凝胶电泳原理和操作步骤 原 理琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。操作步骤：1. 将凝胶成形模具两端用医用胶布封好，水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间。2. 称取DNA电泳用琼脂糖0.8g放入250ml的三角烧瓶中，加入100ml 1×TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于电炉上，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。3. 关闭电炉，取下三角烧瓶，将其置室温下冷却至70℃左右(手握烧瓶可以耐受)，再加入溴化乙锭(10mg/ml)5μl，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml。4. 室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，揭去二端胶布，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。5. 在电泳槽加入1×TAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm ? 1 2 3 样品 λDNA/HindⅢ 未酶解质粒 酶解质粒 ? 10μl(1r) 10μl(～2r) 10μl(～2r) 6×点样液 2μl 2μl 2μl? 7. 将上面三管样品置震荡器上混匀，短暂离心。8. 用加样器吸取样品。依序分别加入三个点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。9. 接通电源，调节电压至50伏，电泳90分钟后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。注：1. 细菌噬菌体λDNA全长49.01kb，其序列及酶切位点已研究清楚，它经不同的限制性内切酶消化后可产生不同的电泳带图谱。因为每条区带的DNA长度是已知的，所以被选为基因工程中常用的DNA分子大小标准，与其进行比较计算，即可得到待测DNA片断的长度，λDNA经HindⅢ消化后产生7条区带，依次为23.7；9.46；6.75；4.26；2.26；1.98；0.58(kb)2. 溴化乙锭为一种有毒试剂，使用时一定要戴手套操作，注意防护。仪器与器材1．电泳仪??????????? 2．平式核酸电泳槽???????? 3. 紫外灯试剂与材料：1. 琼脂糖2. 6×点样缓冲液：0.25%溴酚兰、40%蔗糖3. DNA分子量标准：λDNA分子量标准：λDNA/HindⅢ4. 50×TAE电泳缓冲液贮存液配方：(50×)每升242g Tris， 57.1ml??? 冰醋酸， 100ml?? 0.5mol/L EDTA(pH8.0)1×缓冲液浓度：0.04mol/L Tris HAc、0.002mol/L EDTA5. 0.8%琼脂糖：0.8g琼脂糖用100ml 1×TAE沸水浴溶解6. 10mg/ml EB???? 1.0g???? 溴乙锭?? 100ml?? 三蒸水附注：影响DNA片段琼脂糖电泳的几个因素：1. DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。2. 琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。? 琼脂糖凝胶浓度 可分辨的线性DNA片段大小(kb) 0.4 5~60 0.7 0.8~10 1 0.4~6 1.5 0.2~4 1.75 0.2~3 2 0.1~3? 3. DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。4. 电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。