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常用的几种启动子分析方法研究成果 摘要，但是仅包含维管植物;(3)植物顺式作用调控元件(Plant.CARE)数据库[11]不仅收录了植物顺式作用元件，而且收录了植物增强子(enhancer)和抑制子(inhabitor);(4)转录因子(TRANS.FAC)数据库[12]是关于转录因子(transcriptionfactor,TF)在基因组上的结合位点的数据库，数据搜集的对象从酵母到人类;(5)转录调控区数据库(TRRD)[13]是通过不断积累真核生物基因调控区结构.功能特性信息而构建的。　　一般在公共数据库中，如NCBI、UCSC、Ensemble给出的人类基因序列都没有对基因进行详细的标注。不过，有很多在线工具，可以预测和分析基因序列上的启动子、内含子、UTR区等(表1)。　　生物信息学的发展为在线软件预测基因启动子提供了众多有重要价值的参考信息[14].通过生物信息学初步预测启动子相关信息和分析启动子序列及其调控元件，为深入研究启动子及确定其结构和功能奠定了基础[15].唐亮等利用生物信息学技术预测人TLR9基因启动子区域、转录因子结合位点和CpG岛分布[16].HuangWL[17]等在if.then规则的基础上提出了一种新的预测人类和果蝇启动子的方法，并命名为PromHD方法。　　3.2酵母单杂交实验(YeastOne.HybridSystem)　　酵母单杂交技术[18]是一种研究细胞内的蛋白质和DNA序列特异性相互作用的方法。GAL4蛋白作为酵母单杂交系统中的一种典型的转录因子，其DNA结合域接近羧基端，包含多个锌指结构，可以激活酵母半乳糖苷酶激活位点(UAS)，而上游的转录激活结构域能够与RNA聚合酶或转录因子TFIID交互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这个过程中，DNA结合结构域和转录激活域可以完全独立起作用。因此，我们可以将GAL4DNA结合结构域以文库蛋白编码基因取代，一旦表达的蛋白质可与目的基因交互作用，一样能够通过转录激活结构域使RNA聚合酶激活，启动下游报告基因转录[19].酵母单杂交(Y1H)系统[20]是一个功能强大的工具，用来鉴定可以结合到目的DNA元件上的蛋白质，包括cDNA的转录因子[21],甲基化DNA结合蛋白[22]和DNA的复制起点[23]与端粒结合蛋白[24].Y1H系统与酵母双杂交系统(Y2H)在概念上相似，这是由Field和Song[25]在转录激活蛋白的基础上发明的。此方法也在不断地进行改进。Deplancke[26]开发了互换兼容的Y1H系统，不仅方便，高通量，而且可以无偏差地鉴定蛋白质.DNA相互作用。　　酵母单杂交技术在启动子研究中得到了很好的应用。Li等应用酵母单杂交筛选11个碱基库发现TALEs分别激活SCN9A和miR.34b[27].通过酵母单杂交筛选，分离得到两个转录因子IbNAC1和IbWRKY1,而且它们都与SWRE(sporamin蛋白损伤响应元件)的调控序列的sporamin蛋白启动子片段进行交互作用[28].在对拟南芥的研究中，酵母单杂交实验证明WRKY75蛋白结合CAPRICE启动子[29].在烟草叶本生中，EOT1蛋白能够特异激活SlTPS5启动子[30].酵母单杂交作为一种分子生物学技术[19],其过程简单，耗时短，能直接识别并定位顺式作用元件结合的蛋白及其编码序列，而不必用生化手段来纯化蛋白或抗体建立这种复杂的相互作用，并使得确定基因功能不再是一个艰巨的任务，从而更容易进一步理解在真核生物基因表达调控;而且酵母是真核细胞，在酵母体内研究与真核基因表达调控的实际情况接近，天然构象的蛋白也避免了体外研究的不足。Yan和Burgess[31]　　开发了一种酵母逆单杂交系统，它使得快速和全基因组的转录结合靶标的鉴定成为可能。然而酵母细胞局限性在于自身因插入靶元件可能会与酵母内源性的表达激活因子发生相互作用，从而激活启动子下游报道基因的表达，这样相应的目的基因片段有可能会被漏检，CollartMA等[32]提出该技术的灵敏度不高，HIS3基因表达相当敏感，甚至对某些非特异性相互作用都能检测到，插入的靶元件可能无需转录激活因子的激活就能激活报道基因的表达，使假阳性克隆的比率得以提高。不过这些非特异的相互作用可通过设计其他技术避免。　　3.3染色质免疫共沉淀(ChIP)　　染色质免疫共沉淀[33.35]是在生理条件下将细胞内的蛋白质与DNA进行交联并在活细胞状态下固定蛋白质.DNA复合物，在超声波作用下将其随机切断成一定长度的染色质片段，然后沉淀该复合物，特异性富集目的蛋白结合的DNA片段，经过DNA纯化以及其鉴定，而获得蛋白质和DNA相互作用的信息。　　利用该技术研究启动子目前通常用的是染色质免疫共沉淀.芯片(ChIP.chip)和将