蛋白质分离纯化技术实验讲义.pdfVIP

. 实验一 蛋白质含量分析（ Bradford 检测法） 一、 实验目的 1、 制作蛋白质浓度标准曲线； 2、 测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。 二、 实验原理 Bradford 法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是 1976 年由 Bradford 建立的，是最常 用的蛋白质快速定量方法。该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝 G-250 （CBB G-250 ）在游离状态下呈红色，最大光吸收在 488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结 合后变为青色，蛋白质 - 染料结合物在 595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含 量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在 2min 左右的时 间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下 1h 内保持稳定。 Bradford 法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质 少。此法的缺点是： 仍有一些物质干扰此法的测定， 主要的干扰物有去污剂、 Triton X-100 、 SDS和 0.1N 的 NaOH。 三、 试剂与器材 1、试剂： 1mg/ml 牛血清蛋白（ BSA）母液；考马斯亮蓝 G-250 ；无水乙醇； 85%磷酸； MiliQ 水。 2、器材： 滤纸；烧杯；漏斗；可见分光光度计；试管。 四、 实验方法 1、 考马斯亮蓝 G-250 染料的配置 称 100 mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于 47.5 ml 无水乙醇后，再加入 100 ml 85% 的磷酸， 加 MiliQ 水定容至 1 L ，过滤备用。 2、 标准蛋白溶液的稀释 取 10 支试管，按表中顺序排列，分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。 每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除） 。未知样 品的编号为 8 、9、 10 号管。 3、 加完试剂 2-5min 后，即可用比色皿，在分光光度计上测定各样品在 595nm 处的吸光值 595 OD 。 注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色） ，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即 用少量 95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 4、 标准曲线制作 595 以标准蛋白的量（ mg）为横坐标，吸光值 OD 为纵坐标作图，即得一条标准曲线。由此 595 标准曲线，求得趋势线以及公式（ y=ax+b ，其中 y 为吸光度值 OD ，x 为蛋白质的量， a 2 2 和 b 为常量）并给出 R 值， R 值越接近 1 证明曲线越接近实际结果，根据此公式及未知 样品的吸光度值，计算每管中加入的未知蛋白的量，进而推算其浓度。 5、 本实验采用的未知样品为麦曲中糖化酶分离纯化实验所得的粗酶液样品。 . . 五、 实验结果记录 595 OD 记录表 管