细胞计数和存活率的测定.doc

细胞计数和存活率的测定 目的 学会细胞计数和鉴别细胞死活的方法。 实验前的思考 体外培养细胞常常需要测定细胞的培养密度，即单位体积内的细胞数，同时还需要鉴别细胞的死活，从而了解细胞的存活情况。细胞密度测定最常用的工具是血球计数板，细胞死活测定的最简单方法是染料排斥法，常用鉴别染料为台酚蓝。 材料器具 蟾蜍或小白鼠的骨髓细胞；显微镜，血球计数板，吸管，培养皿，试管，软布或擦镜纸；0.4%台酚蓝染液，两栖动物生理盐水（0.65%氯化钠溶液）或哺乳动物生理盐水（0.9%氯化钠溶液）。 步骤 1.制备骨髓细胞悬液 具体方法参见第660页实验“赡蜍骨髓细胞染色体的制备”。 2.细胞计数准备 取一副血球计数板，用软布或擦镜纸擦净，把盖玻片盖在血球计数板中央的计数室上。把上述制得骨髓细胞悬液摇匀，用吸管吸取少量细胞悬液轻轻地滴在计数室边缘的斜面上，让它自然地流入盖玻片下的空隙，均匀地充满在计数室内。悬液不能过多或过少，过多会使盖玻片浮起，过少会出现空隙或气泡。如果有上述现象必须洗去，擦干重做，否则会影响计数准确性。 3.细胞计数方法 静置2～3分钟，待细胞在计数室下沉后，在低倍镜下计数（详见本书第777页实验《血细胞的计数》。 4.细胞存活力鉴别 取0.5毫升骨髓细胞悬液放入小试管里，再加0.4%台酚蓝染液0.5毫升，用吸管轻轻吹打混匀，染色2～3分钟。然后把悬液摇匀，吸取悬液滴一滴在干净载玻片上，加盖玻片，在低倍镜下，随机计数上、下、左、中、右五个视野内的细胞总数和被染成蓝色的细胞数，蓝色细胞为死细胞，按以下公式计算细胞存活率： 上述细胞计数和细胞存活力测定也可以合并在一起做。 分析和讨论 1.细胞计数时，应该先调焦，看清计数板上的格线。细胞密度太高时，计数不便，应该先把原液稀释若干倍后再计数，随后把测得结果乘以稀释倍数即为原液细胞密度。计数时，以每大格点数在几十到一百多为宜。 2.台酚蓝染液一般不能渗透到活细胞里，所以活细胞不会着色。但是如果延长染色时间或提高染液的浓度，造成活细胞膜损伤时，活细胞也可着色。所以，使用中应该掌握好有关条件。